張松迪 王曉東 艾柯代·玉蘇甫 哈地利亞·哈斯木 帕麗達(dá)·阿布利孜
(**醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科,烏魯木齊 830011)
隨著糖皮質(zhì)激素、抗生素、介入性操作技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及老齡化、免疫受損人群數(shù)量增多,侵襲性真菌感染的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。侵襲性念珠菌病是最常見的侵襲性真菌感染,死亡率達(dá)50%左右,已成為危重癥患者面臨的巨大威脅[1]。由于日漸廣泛的預(yù)防性和經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗真菌藥,菌株的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)峻,特別是多重耐藥“超級(jí)真菌”耳念珠菌的出現(xiàn)已引起了全世界范圍的密切關(guān)注[2]。由于侵襲性念珠菌病的流行病學(xué)和耐藥情況存在地域差異,本文將調(diào)查分析本院侵襲性念珠菌感染分離菌株的流行分布情況以及耐藥特點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上探討真菌耐藥的分子機(jī)制,以期為當(dāng)?shù)厍忠u性真菌病的臨床診治提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 標(biāo)本來源
收集2022年6月—2023年6月**醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為侵襲性真菌病住院患者的無菌體液、分泌物、支氣管肺泡灌洗液、痰液等標(biāo)本中的菌株,共計(jì)125株。剔除同一患者同一部位重復(fù)送檢的同種菌株以及首次培養(yǎng)陽性前一周內(nèi)接受抗真菌治療患者的分離菌株。
1.2 設(shè)備與試劑
Sensititer YeastOne YO10真菌藥敏板(Thermo Fisher公司);Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;PCR引物的合成及產(chǎn)物雙向測(cè)序委托上海生工生物工程有限公司。PCR儀(美國ABI公司)、高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)、凝膠成像儀(上海復(fù)日科技有限公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)。
1.3 方法
菌種培養(yǎng)及鑒定 所有標(biāo)本接種于顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉)上并置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d,觀察菌落形態(tài)及顏色進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,并對(duì)菌株核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)( internal transcribed space,ITS)測(cè)序進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。
抗真菌藥體外敏感性檢測(cè) 按照 Sensititer YeastOne YO10真菌藥敏板說明書進(jìn)行操作,測(cè)定菌株對(duì)藥敏板上所包被的9種抗真菌藥(氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶)的最低抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)。藥敏結(jié)果依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)最新文件[3]的臨床折點(diǎn)(clinical breakpoints,CBPs)判讀,沒有臨床折點(diǎn)的參考流行病學(xué)界值(epidermiological cutoff values,ECVs)[4]來判讀。選擇近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC6258為質(zhì)控菌株。
目的基因的提取、擴(kuò)增和測(cè)序 按照Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒說明書對(duì)分離出的33株唑類耐藥念珠菌提取基因組DNA。依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中念珠菌ERG11基因序列(genBank accession no.NC_032093.1(白念珠菌);M23673.1 (熱帶念珠菌);L40389.1 (光滑念珠菌);AF531428.1(克柔念珠菌);NW_023503279.1(近平滑念珠菌)和NC_005967.2(光滑念珠菌)的PDR1基因設(shè)計(jì)引物來測(cè)序,引物序列見表1。
表1 PCR引物
(續(xù)表)
PCR反應(yīng)總體系為25 μL：上下游引物各1 μL,dNTP(mix)1 μL,Taq酶0.2 μL,PCR緩沖液2.5 μL,ddH2O 18.3 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR反應(yīng)參數(shù)：①預(yù)變性：94 ℃ 5 min; ②擴(kuò)增：94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s,共35次循環(huán)擴(kuò)增;③終延伸：72 ℃ 8 min;于4 ℃下保存。由上海生工生物工程有限公司對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物采用Sanger法行雙向測(cè)序。利用SnapGene4.1.8軟件將擴(kuò)增的產(chǎn)物基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫提供的基因序列進(jìn)行比對(duì)以確定基因突變位點(diǎn)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
用SPSS 22和Origin2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或構(gòu)成比表示,采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù);P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 菌種鑒定及分布情況
送檢樣本經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后,共鑒定111株酵母菌,包括兩株少見酵母菌Wickerhamomycesonychis和Magnusiomycescapitatus以及109株念珠菌,其中最常見的是白念珠菌(56/111,50.45%),然后依次為光滑念珠菌(20/111,18.02%)、熱帶念珠菌(17/111,15.32%)和克柔念珠菌(8/111,7.21%),見圖1、2。菌株的體液標(biāo)本來源主要來自于痰液(87,78.38%)、尿液(17,15.32%)、支氣管肺泡灌洗液(4,3.6%)。除了糞便和咽拭子之外,其他的體液標(biāo)本中最常分離的前幾位菌種依次為白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌,見表2。分離的菌株主要來自13個(gè)科室,主要分布于呼吸科(41.44%)、重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)(30.63%)和感染科(9.01%),見表3。
2.2 體外抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本研究僅對(duì)有CBPs和ECV以及例數(shù)≥3的菌株進(jìn)行分析。多數(shù)念珠菌對(duì)兩性霉素B及5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)高度敏感(見表4)。三種棘白菌素類藥物對(duì)常見念珠菌均表現(xiàn)出良好的體外抗真菌活性,其中白念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和葡萄牙念珠菌對(duì)所有的棘白菌素類藥物均敏感。熱帶念珠菌對(duì)阿尼芬凈和米卡芬凈的敏感率為100%(5.88%的菌株對(duì)卡泊芬凈表現(xiàn)為中介)。光滑念珠菌對(duì)阿尼芬凈、米卡芬凈、卡泊芬凈的敏感率分別為90%、90%和85%。此外,發(fā)現(xiàn)1株光滑念珠菌同時(shí)對(duì)3種棘白菌素類藥物耐藥(見表4)。
念珠菌對(duì)氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑的耐藥率分別是7.1%、7.1%、3.6%、10.7%;光滑念珠菌對(duì)伏立康唑和泊沙康唑耐藥率較高(70%和45%),明顯高于氟康唑和伊曲康唑(5%);熱帶念珠菌對(duì)泊沙康唑的耐藥率最高(64.71%),對(duì)氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐藥率分別為23.53%、11.76%和17.65%。克柔念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥率為12.5%(氟康唑除外)。葡萄牙念珠菌對(duì)所有唑類藥物均敏感,近平滑念珠菌對(duì)泊沙康唑和伊曲康唑100%敏感,對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別是33.33%和0(對(duì)伏立康唑有33.3%表現(xiàn)為中介),見表5。本研究中共發(fā)現(xiàn)33株念珠菌(6株白念珠菌、14株光滑念珠菌、11株熱帶念珠菌、1株克柔念珠菌和1株近平滑念珠菌)為唑類耐藥/非野生株。
2.3 目的基因測(cè)序結(jié)果
對(duì)33株唑類耐藥或非野生型念珠菌菌株所提取的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增均獲得了大小與DNA Marker位置相符并且無非特異性產(chǎn)物的條帶。將上述菌株的ERG11和PDR1基因測(cè)序結(jié)果分別進(jìn)行blast比對(duì),將起始密碼子ATG中的A計(jì)作1來確定突變位點(diǎn)。
圖1 菌種鑒定情況：A.念珠菌鈣熒光白染色鏡下形態(tài)(×400),①～④：白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌;B.念珠菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鑒定,a～d分別為克柔念珠菌、光滑念珠菌、白念珠菌、熱帶念珠菌;C.部分念珠菌ITS區(qū)基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖
ERG11基因測(cè)序結(jié)果顯示6株白念珠菌共發(fā)現(xiàn)兩處錯(cuò)義突變(E266D 和(V488I);在11株熱帶念珠菌中僅有1株發(fā)生錯(cuò)義突變(Y132F和S154F),還有8株發(fā)生同義突變,另外2株未發(fā)生突變;14株光滑念珠菌中有兩株發(fā)生錯(cuò)義突變,分別為K108N和T293I,其余菌株均發(fā)生同義突變;而在克柔念珠菌和近平滑念珠菌中未發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變。14株光滑念珠菌中PDR1基因共發(fā)現(xiàn)7處錯(cuò)義突變(D243N、S76P、V91I、L98S、T143P、F948S、K425R),見表6。
圖2 菌株分布情況
表2 菌株標(biāo)本類型分布
表3 菌株科室分布
近年來侵襲性念珠菌病的發(fā)病率逐漸上升,但治療侵襲性真菌感染的藥物種類有限,耐藥菌株的出現(xiàn)常引起治療失敗而給臨床帶來了極大挑戰(zhàn)[5]。隨著抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用,侵襲性念珠菌病的致病菌種分布有一定變異和地區(qū)差異,非白念珠菌感染比例逐漸增高,在某些地區(qū)甚至已經(jīng)超過了白念珠菌[6]。本研究收集的侵襲性念珠菌病菌種以白念珠菌為主,與我國兩項(xiàng)大型多中心研究[7-8]結(jié)果一致。非白念珠菌以光滑念珠菌和熱帶念珠菌的分離率最高,與國外部分研究報(bào)道[9-10]一致。我國一些單中心研究[11-14]顯示非白念珠菌的優(yōu)勢(shì)菌種是光滑念珠菌,但在一些大樣本的多中心研究[15-17]中最常分離的非白念珠菌是近平滑念珠菌,可見致病菌種的分布存在一定的地域差異,可能與菌株分離標(biāo)本的來源及種類、不同的患病人群以及抗真菌藥物的選擇應(yīng)用等多種因素有關(guān),這提示我們有必要對(duì)當(dāng)?shù)厍忠u性念珠菌的流行病學(xué)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
表4 常見念珠菌對(duì)棘白菌素、5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的體外藥敏結(jié)果
表5 常見念珠菌對(duì)唑類的體外藥敏結(jié)果
表6 唑類耐藥/非野生型念珠菌中相關(guān)基因突變
從菌株分布科室來看,本研究收集的菌株主要分布于呼吸科、ICU和感染科,這可能因?yàn)檫@些科室患者病情相對(duì)復(fù)雜和危重,廣譜抗生素的應(yīng)用率較高以及侵入性操作技術(shù)和侵襲性生命支持的應(yīng)用相對(duì)較多,導(dǎo)致機(jī)體微生態(tài)紊亂、菌群失調(diào)、免疫屏障破壞進(jìn)而增加了條件致病菌感染的機(jī)率。在臨床工作中我們應(yīng)對(duì)這些科室重點(diǎn)關(guān)注、早期識(shí)別易感的高危人群,完善相應(yīng)的防治措施。
本研究體外抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示念珠菌整體對(duì)兩性霉素B和5-FC高度敏感,對(duì)唑類藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥。白念珠菌對(duì)唑類藥物較為敏感(敏感率89.29%～92.86%),非白念珠菌對(duì)唑類藥物的敏感性相對(duì)較低,如光滑念珠菌對(duì)伏立康唑、熱帶念珠菌對(duì)泊沙康唑的耐藥率高達(dá)64.7%和70%,這與目前國內(nèi)外研究[18-19]報(bào)道的耐藥流行趨勢(shì)相一致,與其他種類的念珠菌相比,光滑念珠菌和熱帶念珠菌對(duì)唑類藥物具有天然的異質(zhì)耐藥性,更易發(fā)生唑類耐藥。棘白菌素類藥物因其對(duì)唑類耐藥念珠菌具有良好的抗菌活性和獨(dú)特的抗菌機(jī)制在臨床上應(yīng)用逐漸增多,目前棘白菌素類藥物被推薦作為治療侵襲性念珠菌病的一線治療藥物[20-21],值得關(guān)注的是近年來棘白菌素類藥物的耐藥現(xiàn)象正在逐漸增多,可能是隨著藥物的廣泛應(yīng)用而帶來的選擇性壓力有關(guān),耐藥現(xiàn)象在光滑念珠菌中尤為顯著。國內(nèi)外學(xué)者均報(bào)道了光滑念珠菌對(duì)棘白菌素類藥物的耐藥現(xiàn)象[9,22],美國的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[23]光滑念珠菌對(duì)棘白菌素耐藥率超過了10%。本研究結(jié)果(見表4)顯示,棘白菌素類藥物對(duì)多數(shù)念珠菌具有良好的抗菌活性,但光滑念珠菌對(duì)棘白菌素的耐藥率達(dá)5%～10%。雖然棘白菌素類藥物在我國普及稍晚,其耐藥現(xiàn)象在臨床上并不常見,但發(fā)生光滑念珠菌感染時(shí)我們?nèi)孕杳芮嘘P(guān)注藥敏情況并注意用藥選擇。
唑類抗真菌藥因經(jīng)濟(jì)、相對(duì)安全有效在臨床上應(yīng)用最為廣泛,念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥現(xiàn)象也最為常見,探索其耐藥機(jī)理有助于推進(jìn)侵襲性念珠菌病的治療方案的選擇和改善患者預(yù)后。ERG11基因[24-25]編碼真菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成途徑關(guān)鍵酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶,該酶是唑類藥物的作用靶點(diǎn),ERG11基因突變可導(dǎo)致靶酶構(gòu)象改變、影響藥物和靶酶的結(jié)合而導(dǎo)致耐藥。念珠菌的唑類耐藥機(jī)制常與ERG11基因突變有關(guān)[24],然而光滑念珠菌對(duì)唑類耐藥機(jī)制主要與鋅簇轉(zhuǎn)錄因子編碼基因PDR1突變有關(guān),PDR1基因突變可上調(diào)外排泵編碼基因CDR1、CDR2及SNQ2而導(dǎo)致唑類耐藥[26-27]。本研究共收集33株唑類耐藥/非野生型念珠菌,這些菌株的ERG11基因測(cè)序結(jié)果示白念珠菌共發(fā)現(xiàn)16處突變位點(diǎn),其中3處發(fā)生錯(cuò)義突變(D116E、E266D和V488I)。這些錯(cuò)義突變雖然常見于唑類耐藥株中,但已有研究[28]發(fā)現(xiàn)這些突變與耐藥無關(guān),這也證實(shí)了菌株中還存在其他的耐藥機(jī)制;耐藥熱帶念珠菌ERG11基因共發(fā)現(xiàn)7處突變位點(diǎn),其中2處發(fā)生Y132F和S154F錯(cuò)義突變,這兩個(gè)位點(diǎn)位于基因突變熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi),已經(jīng)研究[29-30]證實(shí)可導(dǎo)致唑類耐藥;光滑念珠菌ERG11基因中發(fā)現(xiàn)了兩處錯(cuò)義突變(K108N和T293I),目前ERG11基因突變尚未被報(bào)道作為一種重要的機(jī)制參與光滑念珠菌唑類耐藥,關(guān)于此機(jī)制的研究報(bào)道數(shù)量有限,本研究中新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)是否與耐藥相關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外,本研究在14株耐藥光滑念珠菌中均檢測(cè)到PDR1錯(cuò)義突變,其中S76P、V91I 、L98S、 T143P、D243N突變經(jīng)證實(shí)可導(dǎo)致外排泵編碼基因CDR1或CDR2的表達(dá)上調(diào)而發(fā)生唑類耐藥[31-32];K425R、F948S為新發(fā)現(xiàn)的突變,新的變異位點(diǎn)還需進(jìn)一步研究來證實(shí)是否與耐藥相關(guān)。
綜上所述,我院侵襲性念珠菌病的主要致病菌是白念珠菌,侵襲性念珠菌病致病菌種對(duì)棘白菌素類藥物、兩性霉素B、5-FC較為敏感,非白念珠菌特別是熱帶念珠菌和光滑念珠菌的唑類耐藥率較高,我們需謹(jǐn)慎合理地選擇抗菌藥物、及時(shí)行動(dòng)態(tài)藥敏監(jiān)測(cè)及對(duì)致病菌種進(jìn)行流行病學(xué)特征分析。本研究在唑類耐藥/非野生型的白念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的ERG11基因和PDR1基因發(fā)現(xiàn)了可介導(dǎo)唑類耐藥的錯(cuò)義突變,由于念珠菌耐藥機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,本研究中未發(fā)生突變、存在同義突變以及經(jīng)證實(shí)發(fā)生的突變與耐藥無關(guān)的耐藥株中是否還存在其他的耐藥機(jī)制仍需深入和持續(xù)性的研究來明確。未來應(yīng)繼續(xù)收集更多的樣本,對(duì)可能與耐藥相關(guān)的錯(cuò)義突變運(yùn)用軟件對(duì)ERG11蛋白質(zhì)同源分子建模分析預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)的功能,還可構(gòu)建耐藥突變位點(diǎn)異位表達(dá)的菌株來檢測(cè)耐藥表型以進(jìn)一步證實(shí)基因突變位點(diǎn)與耐藥的關(guān)系,并對(duì)PDR1調(diào)控的下游基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析以驗(yàn)證PDR1基因突變對(duì)耐藥的影響。此外,可進(jìn)一步結(jié)合樣本的臨床特征、危險(xiǎn)因素、預(yù)后結(jié)局等來進(jìn)行綜合分析,為我院侵襲性念珠菌病的診治提供更詳盡的科學(xué)依據(jù)。
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