王慶武，叢倩倩，孔 怡，李秀梅，崔 曉，安秀榮
（泰安市農(nóng)業(yè)科學院，山東 泰安 271000）
黑木耳（Auricularia auricula）是我國第二大食用菌栽培品種，產(chǎn)量占世界的90%以上[1]。隨著北耳南擴及鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興的發(fā)展，黑木耳規(guī)模化、工廠化栽培逐步加速，原有固體菌種制作技術(shù)已跟不上產(chǎn)業(yè)發(fā)展的節(jié)奏。液體菌種因具有培養(yǎng)周期短、菌齡一致、發(fā)菌快等優(yōu)點，且有利于進行工廠化生產(chǎn)，越來越受到食用菌生產(chǎn)企業(yè)的青睞，已成為當前食用菌制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢[2]。液體菌種同固體菌種一樣，需要一定的培養(yǎng)條件，才能制備出優(yōu)質(zhì)菌種，以滿足生產(chǎn)需要[3]。本研究以菌絲體生物量作為評價指標，對黑木耳液體菌種制備條件進行了優(yōu)化，旨在獲得菌絲體含量高、菌絲活力強、成本低的優(yōu)質(zhì)液體菌種，為黑木耳菌種工廠化生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級提供技術(shù)支持[4-7]。
1.1 試驗材料
1.1.1 供試菌株
黑木耳菌株“黑威11號”，黑龍江省科學院微生物研究所。
1.1.2 培養(yǎng)基配方
斜面培養(yǎng)基配方：馬鈴薯20%（去皮煮汁）、麥麩4%（煮汁）、葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、瓊脂2%，水1 L。
液體培養(yǎng)基配方：玉米粉3%、淀粉4%、酵母膏0.1%、麥麩0.2%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、維生素B10.015%、花生油0.03%，水1 L，pH自然。
1.1.3 發(fā)酵罐
容積為100 L的發(fā)酵罐，氣流式攪拌，裝液量為容積的75%。
1.2 試驗方法
1.2.1 母種制備
取冰箱內(nèi)保藏的黑木耳母種，在無菌條件下挑取邊長為4 mm×4 mm的菌種塊，接種于新的斜面培養(yǎng)基上，于溫度為24℃～28℃下培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，待用。
1.2.2 不同接種塊大小處理
250 mL三角燒瓶中裝入150 mL液體培養(yǎng)基，0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫備用。無菌條件下各取1 cm×1 cm的母種塊，分別平均分成大小為10 mm×10 mm、10 mm×5 mm、5 mm×5 mm、2.5 mm×2.5 mm、小于2.5 mm×2.5 mm的母種塊，接入液體培養(yǎng)基中，靜置24 h。置于轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的恒溫搖床上，25℃～28℃培養(yǎng)7 d。每個處理5次重復。
1.2.3 不同培養(yǎng)溫度處理
液體培養(yǎng)基制備方法同1.2.2，無菌條件下接入1.2.2制備的菌絲生物量最高的液體菌種，接種量1%。置于轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的搖床中，分別于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃條件下培養(yǎng)5 d。每個處理5次重復。
1.2.4 不同裝液量處理
250 mL三角燒瓶中分別加入100 mL、150 mL、200 mL液體培養(yǎng)基，0.11 MPa條件下高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫后接種。接種量、接種方法同1.2.3。于24℃～28℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的恒溫搖床培養(yǎng)5 d。每個處理5次重復。
1.2.5 不同接種量處理
液體培養(yǎng)基制備同1.2.2。無菌條件下接入1.2.3中制備的液體菌種，接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，于24℃～28℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的搖床培養(yǎng)5 d。每個處理5次重復。
1.2.6 不同轉(zhuǎn)速處理
液體培養(yǎng)基制備同1.2.2，接種量、接種方法同1.2.3。分別置于轉(zhuǎn)速為 120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1的恒溫搖床上，于 24 ℃～28℃條件下培養(yǎng)5 d。每個處理5次重復。
1.2.7 不同通氣量處理
在100 L發(fā)酵罐中裝入液體培養(yǎng)基75 L，于0.11 MPa的高壓下蒸汽滅菌50 min，冷卻后無菌條件下在搖瓶中接入液體菌種700 mL，24℃～28℃條件下培養(yǎng)，設(shè)置4個不同通氣量處理。每分鐘通氣量以體積比表示，分別為1.0∶0.4、1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0。每個處理3次重復。
1.2.8 不同培養(yǎng)時間處理
液體培養(yǎng)基的制備方法、接種方式、培養(yǎng)溫度與1.2.7中相同，每分鐘通氣量的體積比為1.0∶0.8。研究培養(yǎng)時間對液體菌種培養(yǎng)的影響。
1.2.9 菌絲體生物量的測定
將各處理菌液移入50 mL離心管中，離心機中10 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，稱量鮮菌絲體的質(zhì)量。每個處理3次重復。
1.2.10 統(tǒng)計分析
記錄每個處理菌絲生長情況，以菌絲體生物量為衡量指標，進行統(tǒng)計分析。
2.1 接種塊大小對液體菌種的影響
接種塊大小對液體菌種的影響見表1。
從表1可以看出，接種塊大小對液體菌種有影響。同等大小的母種塊分成不同大小的接種塊，隨接種塊越來越小，液體菌種菌絲體生物量越來越高，菌絲球球徑也越來越小，且部分成菌絲段。接種塊小于2.5mm×2.5mm時，菌絲體生物量最高、球徑最小、菌絲球與菌絲段共存。
表1 接種塊大小對液體菌種的影響Tab.1 Effect of inoculation block size on liquid spawn
2.2 溫度對液體菌種的影響
培養(yǎng)溫度對液體菌種的影響見表2。
從表2可以看出，培養(yǎng)溫度對液體菌種有影響。低溫和高溫均不利于菌絲的生長，菌絲體生物量低；
培養(yǎng)溫度為24℃～28℃時，菌絲體生物量差異不顯著，菌絲體均以菌絲球的形態(tài)存在，且球徑小，培養(yǎng)溫度為26℃時，菌絲體生物量最高。
表2 溫度對液體菌種的影響Tab.2 Effect of temperature on liquid spawn
2.3 裝液量對液體菌種的影響
裝液量對液體菌種的影響見表3。
從表3可以看出，裝液量對液體菌種有影響。在相同接種量下，裝液量越多，菌絲體生物量越低，菌絲球的直徑越大，大菌絲球的占比增加；
適宜的裝液量為150 mL，即液體部分約占容器的60%。
表3 裝液量對液體菌種的影響Tab.3 Effect of medium volume on liquid spawn
2.4 轉(zhuǎn)速對液體菌種的影響
轉(zhuǎn)速對液體菌種的影響見表4。
表4 轉(zhuǎn)速對液體菌種的影響Tab.4 Effect of rotation speed on liquid spawn
從表4可以看出，搖床轉(zhuǎn)速對液體菌種有影響。轉(zhuǎn)速過低，菌絲體生物量少，菌絲體以菌絲球狀態(tài)存在，球徑大，大球占比高；
轉(zhuǎn)速過高，菌絲體生物量也減少，菌絲體以菌絲球和菌絲段共存，菌絲段較多，球徑小，大球占比最小。當搖床轉(zhuǎn)速為160 r·min-1時，菌絲體生物量最高，菌絲球和菌絲段共存，菌絲段少，球徑小，大球占比較少；
其次是轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時，菌絲體生物量較高，菌絲球球徑相對較小，大球占比相對較少。
2.5 通氣量對發(fā)酵菌種的影響
通氣量對發(fā)酵菌種的影響見表5。
表5 通氣量對發(fā)酵菌種的影響Tab.5 Effect of aeration on fermentation spawn
從表5可以看出，通氣量對發(fā)酵菌種有影響。隨通氣量的增加，菌絲體生物量增加，菌絲球含量減少，黏稠度增加。當通氣量增加到1.0∶0.8時，菌絲體生物量最高，菌液黏稠；
當通氣量增加到1.0∶1.0時，菌絲體生物量次之，菌絲完全以菌絲段的形態(tài)存在，菌液黏稠。
2.6 培養(yǎng)時間對發(fā)酵菌種的影響
培養(yǎng)時間對發(fā)酵菌種的影響見表6。
從表6可以看出，培養(yǎng)時間對發(fā)酵菌種有影響。培養(yǎng)1 d，菌絲體生物量增加緩慢；
培養(yǎng)2 d，菌絲擴增倍數(shù)顯著提高，菌絲體生物量逐漸增加；
培養(yǎng)6 d，菌絲擴增倍數(shù)提高緩慢，菌絲體生物量也增加緩慢；
培養(yǎng)9 d，菌絲擴增倍數(shù)降低，菌絲體生物量也隨之降低。菌液pH隨培養(yǎng)時間的延長逐漸降低，第6天開始逐漸升高，直到培養(yǎng)結(jié)束。隨培養(yǎng)時間延長，菌液黏稠度逐漸增加、氣味逐漸加濃、色澤逐漸加深；
培養(yǎng)9 d，菌液黏稠度降低、氣味變淡、色澤變淺。各培養(yǎng)時間段，菌絲體形態(tài)均為絮狀。
表6 培養(yǎng)時間對發(fā)酵菌種的影響Tab.6 Effect of culture time on fermentation spawn
用搖瓶培養(yǎng)黑木耳液體菌種時，接種塊過大，形成的菌絲量少，且接種塊易堵塞接種口和接種槍。培養(yǎng)溫度應(yīng)根據(jù)菌絲生物學特性，控制在適宜范圍內(nèi)，過高或過低均不利于菌絲的生長。搖瓶裝液量過多，培養(yǎng)時易溢出，瓶口有菌液，容易造成污染。搖床轉(zhuǎn)速過低，菌絲打不碎，形成的菌絲球大，易堵槍口，且形成的菌絲量少，接種后萌發(fā)點少；
搖床轉(zhuǎn)速越高，液體培養(yǎng)基中氧氣交換頻率就越高，菌絲生長越快，菌絲生物量越多，但當轉(zhuǎn)速超過一定值時菌絲生長就不隨轉(zhuǎn)速提高而加大了。
液體發(fā)酵菌種制備時，通氣量少，菌液翻動慢，菌絲不易碎，形成的菌絲量少，菌絲球大，易堵槍口；
通氣量大，菌液翻動快，菌絲易碎，菌絲球小，菌絲量多。隨培養(yǎng)時間的延長，菌絲體生物量先快速增加，后緩慢增加，菌液逐漸黏稠，達到一定時間后，菌絲開始自溶，繼續(xù)培養(yǎng)，菌絲量逐漸降低，直至菌絲自溶消失。
綜上所述，黑木耳液體菌種制備時接種塊應(yīng)不大于2.5 mm×2.5 mm、培養(yǎng)溫度為24℃～28℃、裝液量約為 60%、搖床轉(zhuǎn)速為 140 r·min-1～160 r·min-1；
發(fā)酵菌種制備適宜的通氣量為1.0∶0.8～1.0∶1.0、培養(yǎng)時間為6 d～7 d。在該培養(yǎng)條件下，制備的液體菌種菌絲體生物量高、菌絲球小、菌液黏稠、菌齡短、菌絲活力強。