盧藹純，蘇嘉毅，楊迅，冉佳鑫，郭俊斌，唐德劍，祁蒙，夏曾潤，梁興唐，尹艷鎮，曹庸，苗建銀*
（1.華南農業大學食品學院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東廣州 510642）
（2.安康市富硒產品研發中心，陜西安康 725000）
（3.北部灣大學石油與化工學院，欽州市生物廢棄物資源富硒功能化利用重點實驗室，廣西欽州 535011）
核桃（Juglans regiaL.），也被稱為山核桃或羌桃，屬于山核桃科。中國是現在世界上產量較大的天然核桃生產基地國之一和核心消費市場國，近年來核桃產業更是發展迅猛，種植規模和產品產量增長速度逐年上升[1]，2019年中國核桃產量達252.2萬t[2]。但現在我國核桃資源開發利用仍以初級農業產品和榨油為主，作為核桃油加工的副產品，核桃粕的高附加值利用明顯落后于核桃產業，這大大限制了核桃產業的經濟效益和產品的附加值[3]。
硒（Selenium）是動物的一種必需營養素，也是植物的一種有益營養素。在各種生物機體代謝中發揮多種重要生理作用，如參與人類機體硒酶合成和硒蛋白的合成，谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPX）可以以硒半胱氨酸作為活性中心對各種代謝途徑形成的過氧化物進行保護[4]。同時，硒還參與保護DNA免受損傷和預防細胞衰老，影響生殖系統（尤其是男性）、激素（主要是甲狀腺）和免疫功能的正常功能[4]。因此，飲食中缺乏硒會導致許多疾病的發生，包括甲狀腺功能減退、感染易感性、腫瘤、類風濕性關節炎或心力衰竭[4]。流行病學研究結果表明，在世界范圍內，硒缺乏影響多達10億人[5]。因此，如何通過食物資源補充天然硒元素成為近年來研究的熱點，例如富硒牡蠣肽[6]、富硒桑葚果片[7]以及富硒大米酒[8]等的研究。硒對于預防高血壓和冠心病的調控機制有直接清除氧自由基、保護血管內皮細胞、改變血流動力學、調控Ca2+等[9]。研究表明，機體內血栓素B2（Thromboxane B2，TXB2）和6-酮-PGF1α（6-Keto Prostaglandin F1α，6-酮-PGF1α）產生和分解之間的平衡可以控制血管收縮、保護內皮細胞，而硒在這一過程中發揮了重要作用，從而控制血管收縮、保護內皮細胞[9]。程天德等[10]研究發現富硒大豆低聚肽具有降低SHR血壓的作用，認為這種作用是硒和大豆低聚肽共同作用的結果。
高血壓是最常見多發的一種慢性疾病，也是中國所面臨的一個重要公共衛生問題。2012~2015年中國高血壓調查（Chinese Hypertension Survey，CHS）發現，全國有血壓正常高值人數約4.35億，中國年均有250萬人死于與高血壓相關的心血管病[11]。血管緊張素-Ⅰ可以通過血管緊張素轉化酶（Angiotensin- Converting Enzyme，ACE）轉變成以致末端血管產生收縮變化的血管緊張素Ⅱ，同時它還會導致具有擴張血管作用的緩激肽失活，從而導致血壓升高。因此，為了可以積極預防診斷和治療高血壓病人及其心血管疾病，高效安全地降低血壓，可以采取抑制ACE酶活性以提高緩激肽的濃度并降低血管緊張素Ⅱ的產生。目前，在臨床方面化學合成的ACE酶抑制類藥物已具有非常高效的降壓效果，但口服該類藥物后也存在副作用的風險，例如味覺紊亂、咽喉癥狀和皮膚問題等[12]。因此，尋找天然無負作用且經濟可行的替代物成為近年來研究的熱點領域，例如馬面魚皮ACE抑制肽[13]、雙孢菇ACE抑制肽[14]以及馬氏珍珠貝肉蛋白ACE抑制肽[15]的研究。
本研究以富硒核桃粕為原料制備降血壓肽，對富硒核桃粕蛋白降血壓肽的提取工藝進行優化研究，以及富硒核桃粕蛋白降血壓肽對ACE抑制的積極作用，結合硒元素與核桃蛋白降血壓肽的優點，為富硒核桃降血壓肽的進一步研究提供參考依據，還為開發膳食硒補充劑提供了理論基礎，以期促進富硒核桃粕的高值化利用。
1.1 原料與試劑
1.1.1 原料
富硒核桃：購自湖北恩施。
1.1.2 試劑
血管緊張素轉化酶（ACE）、呋喃丙烯酰三肽（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，FAPGG）、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）美國Sigma公司；
胃蛋白酶（300萬U/g）、胰蛋白酶（25萬U/g）、木瓜蛋白酶（20萬U/g）、中性蛋白酶（10萬U/g），廣西南寧龐博生物工程有限公司；
氫氧化鈉溶液，上海麥克林生化科技有限公司；
鹽酸，河南標準物質研發中心；
乙醇，天津市富宇精細化工有限公司；
其他試劑均為分析純。
1.2 主要儀器設備
2300多功能酶標儀，PerkinElmer公司；
HH-1數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；
DK-8D電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；
L530，臺式低速自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；
FD-1型冷凍干燥機，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；
DH5000BII電熱恒溫培養箱，天津泰斯特儀器有限公司；
PHS-3D pH計，上海三信儀表廠；
電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；
DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；
RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；
超聲波清洗儀，深圳市潔盟清洗設備有限公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 富硒核桃粕制備
將富硒核桃脫殼、去衣和粉碎，以本實驗室自有專利保護設備低溫連續相變萃取技術提取核桃油后剩余部分即為脫脂富硒核桃粕。
1.3.2 最優酶篩選
選用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在各自酶最適的pH值及最佳溫度條件下（見表1）對富硒核桃粕蛋白水解液進行單酶酶解3 h。以ACE抑制率為指標，篩選出抑制效果最好的蛋白酶。
表1 蛋白酶最適水解條件Table 1 Optimal hydrolysis conditions for proteases
1.3.3 單因素試驗
確定胰蛋白酶為最優酶后，對影響蛋白酶水解的pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、溫度（30、35、40、45、50 ℃）、酶解時間（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h）、底物濃度（1%、3%、5%、7%、9%，m/V）和加酶量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，V/V）五個因素進行實驗。以酶解液ACE抑制率作為最佳水解條件的指標。
1.3.4 響應面優化
基于單因素實驗，選取主要影響因素，以ACE抑制率為響應值，利用響應面軟件Box Behnken設計三因素三水平響應面實驗。對優化的實驗設計所得實驗結果建立數學回歸模型并分析，進行三次平行的驗證性實驗以驗證優化設計結果，最終確定富硒核桃中降血壓肽的最佳提取工藝。響應面因素與水平設計見表2。
表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of response surface experiment
1.3.5 ACE抑制率的測定
參照陳冰冰等[16]的方法，借助酶標儀采用FAPGG法直接檢測富硒核桃肽的ACE抑制率。配制0.08 mol/L的HEPES-NaOH緩沖液（pH值8.3，含0.3 mol/L NaCl），用適當的緩沖液制備0.1 mol/L的FAPGG溶液和 0.1 U/mL的ACE溶液。在酶標板樣品孔中依次加入40 μL HEPES緩沖液（80 mmol/L），50 μL的FAPGG溶液（1.0 mmol/L），10 μL 0.1 U/mL的ACE溶液，在空白孔依次加入40 μL HEPES緩沖液（80 mmol/L），50 μL的FAPGG溶液（1.0 mmol/L），10 μL 0.1 U/mL的ACE溶液。加入ACE后，立即將其置于酶標儀中，并在340 nm處測量空白孔和樣品孔的吸光度a1、b1，然后立即轉入37 ℃條件下的培養箱中進行保溫，30 min后取出，再次在340 nm處再次測定其反應后的吸光度a2、b2。ACE抑制率（Y）按照下式計算：
式中：
Y——ACE抑制率；
a1——空白孔的吸光度；
b1——樣品孔的吸光度；
a2——培養箱中保溫30 min后空白孔的吸光度；
b2——培養箱中保溫30 min后樣品孔的吸光度。
1.3.6 超濾分離
將酶解液置于3 ku超濾管中，于常溫下4 000 r/min超濾30 min。利用超濾膜的不對稱微孔結構對酶解液組分進行分離，分別收集上層超濾液和下層超濾液，得到＞3 ku的組分和＜3 ku的組分，將超濾組分冷凍干燥制得凍干粉，便于后續ACE抑制率的測定。
1.3.7 氨基酸組成分析
在最優酶解條件下對富硒核桃ACE抑制肽進行冷凍干燥，以獲得的凍干粉即為測定樣品。使用氨基酸分析儀（SYKAM-S433D），參照食品安全國家標準GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》中酸水解的方法處理，在570 nm+440 nm的波長下，以外標法檢測樣品液中16種氨基酸的濃度[17]。
1.3.8 硒含量分析
采用氫化物原子熒光光譜法測定市售核桃、富硒核桃及其蛋白酶解物、分子量＞3 ku的肽和＜3 ku肽的硒含量。在適量樣品中加入9 mL濃硝酸和1 mL高氯酸混合物在150 ℃下消化2.5 h。樣品經消化后，在6 mol/L鹽酸介質中，將試樣中的Se6+還原成Se4+。冷卻后移至25 mL容量瓶定容。將10.0 mL試樣消化液移入15 mL離心管中，加入6 mol/L濃鹽酸2.0 mL，鐵氰化鉀溶液10%（m/m）1.0 mL，混合后放置2 h進行測量。用原子熒光光譜法測定硒的含量，每個處理組取3次數據平均值，同時做空白對照。
儀器條件為：負高壓280 V，硒燈電流80 mA，原子化器高度8 mm，載氣流量為300 mL/min；
屏蔽氣流量為800 mL/min，讀數時間12 s，延遲時間3 s。
1.3.9 數據的統計分析
實驗數據的采集均以平均值±標準偏差來計算表示，各部分實驗均至少需要進行最少3次的平行試驗，采用Excel 2019和Design-Expert V8.0.6.1等統計及分析報表軟件進行數據分析。
2.1 最優酶篩選結果
在5%底物濃度和0.3%酶添加量的條件下，分別在4種蛋白酶酶解反應最適pH值和最適酶解溫度條件下酶解反應3 h，用酶標儀測出ACE抑制率如圖1。
圖1 蛋白酶種類對酶解物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of protease species on ACE inhibition of enzymatic digests
由圖1可知，在不同酶對應最適酶解條件下，胰蛋白酶的酶解產物在酶標儀測定下表現出了最高的ACE抑制率，高達68.00%，與胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的ACE抑制率相比差異顯著，其次是中性蛋白酶，ACE抑制率為58.67%，而木瓜蛋白酶酶解產物在酶標儀的測定下表現出了最低的ACE抑制率，僅能表現為22.67%。由于不同種類的蛋白酶作用于富硒核桃蛋白的不同部位，酶解得到的富硒多肽片段也有所不同，表現出的ACE抑制率也存在差異。在大米ACE抑制肽[18]和龍須菜ACE抑制肽[19]的研究中也表明經胰蛋白酶酶解得到ACE抑制肽活性最高。因此，選擇胰蛋白酶作為酶解富硒核桃的最優酶進行后續研究。
2.2 單因素試驗結果
2.2.1 溫度對ACE抑制率的影響
酶解溫度對ACE抑制率的影響結果見圖2，當反應溫度達到35 ℃時，ACE抑制率為75.00%，達到最大值；
當反應溫度達到40 ℃左右時，ACE抑制率為74.70%，略低于反應溫度35 ℃時的，然而ACE抑制率隨著反應溫度的升高逐漸下降。因此，選擇35 ℃為最佳反應溫度。
圖2 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of enzymatic digestion temperature on ACE inhibition rate
圖3 pH值對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of pH value on ACE inhibition rate
2.2.2 pH值對ACE抑制率的影響 不適的pH值很可能會直接導致酶的正常空間結構遭到不同程度上的破壞，致使了酶活性降低[20]，最終導致ACE抑制率降低。因此，選擇溶液pH值7.5為最佳的反應條件。
2.2.3 時間對ACE抑制率的影響
酶解時間長短對ACE抑制率的影響見圖4。隨著酶解時間的增加，ACE抑制率先增高后降低，在酶解時間為3 h，ACE抑制率高達74.39%。酶解時間在3 h以內時，隨著酶解時間的逐步延長，ACE抑制率不斷攀升，這是因為酶解過程還沒有結束，酶解物含量越來越多，ACE抑制率也隨之增加；
而在酶解3 h以后，ACE抑制率逐漸降低，可能是因為某些對ACE有抑制作用的短肽被繼續酶解成活性小的短肽甚至被過度酶解后失去活性，這在牡丹籽ACE抑制肽[21]和鯽魚加工下腳料ACE抑制肽[22]研究中也有類似的變化趨勢。因此，選擇酶解時間3 h為最佳反應條件。
圖4 酶解時間對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzymatic digestion time on ACE inhibition rate
2.2.4 底物濃度對ACE抑制率的影響
底物濃度高低對ACE抑制率的影響結果見圖5。酶解產物的ACE抑制率呈現先升高后降低的趨勢，在底物濃度低于5%時，僅達到30%~35%，可能是由于底物太少，導致酶解產物較少，導致ACE抑制率較低；
當底物濃度升至5%時，其抑制率達到最大值73.49%。當底物濃度繼續增大時，ACE抑制率反而降低，原因可能是當底物濃度水平過高時，造成了反應體系中液體黏度增大，阻礙了蛋白質和酶的擴散，在酶解反應過程中起了抑制作用[23]，ACE抑制率也隨之出現下降。因此，選擇底物濃度為5%為最佳反應條件。
圖5 底物濃度對ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on ACE inhibition rate
2.2.5 加酶量對ACE抑制率的影響
加酶量對ACE抑制率的影響如圖6。由結果可知，隨著酶量的增加，ACE抑制率呈現出先增高后降低的趨勢，在加酶量為0.5%時達到峰值75.09%。當加酶量持續增大，抑制率反而降低，因為多余的蛋白酶把具有ACE抑制活性的短肽繼續酶解[24]，導致ACE抑制率的下降，而且還會造成資源浪費，需同時考慮成本問題和高ACE抑制活性[16,25]。因此，選用加酶量為0.3%為最佳反應條件。
圖6 加酶量對ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of enzyme addition on ACE inhibition rate
2.3 響應面試驗結果
2.3.1 模型建立與方差分析
根據單因素試驗的結果，采用Box-Behnken中心組合試驗，以酶解時間、底物濃度、加酶量為試驗因素，以ACE抑制率為響應值，進行三因素三水平的響應面分析試驗以優化富硒核桃ACE抑制肽的酶解工藝，所得響應面實驗設計和初步研究試驗結果見表3。
表3 響應面實驗結果Table 3 Response surface experimental results
根據響應面實驗設計和實驗結果，以ACE抑制率為響應值的二次回歸方程如下：
回歸模型方差分析見表4。基于方差分析結果建立回歸模型P＜0.01，模型極顯著，表明該模型結果與實際分布情況擬合很好，可以用于富硒核桃酶解試驗。得出R2=0.90，R2adj=0.76，說明模型可以較好地反映響應值的變化；
失擬項不顯著，回歸模型和預測值之間有較好的擬合度。
表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance
借助時間、底物濃度、加酶量的實驗設計優化，以獲得對應的數據分析。從二次方程的回歸系數中得知，因素A（時間）、C（加酶量）對酶解富硒核桃ACE抑制率影響顯著；
因素B（底物濃度）對酶解富硒核桃ACE抑制率影響不顯著；
交互項影響均不顯著；
二次項A2對酶解富硒核桃ACE抑制率影響極顯著、B2對酶解富硒核桃ACE抑制率影響顯著。
根據回歸模型構建相應的響應面和等高線 （圖7~9），并從不同因素角度分析響應面，響應面等高線圖可以直觀地反映各因素對響應值的影響，能找到最佳工藝參數和各參數之間的關系，等高線圖形中最小橢圓的中心點即為響應面的最高點[26]。
圖7 酶解時間和底物濃度對酶解反應ACE抑制率的影響響應面圖與等高線Fig.7 Response surface plots and contours of the effect of enzymatic digestion time and substrate concentration on the ACE inhibition rate of the enzymatic reaction
圖8 酶解時間和加酶量對酶解反應ACE抑制率的影響響應面圖與等高線Fig.8 Response surface plots and contours of the effect of enzymatic digestion time and enzyme addition on the ACE inhibition rate of the enzymatic reaction
圖9 底物濃度和加酶量對酶解反應ACE抑制率的影響響應面圖與等高線Fig.9 Response surface plots and contours of the effect of substrate concentration and enzyme addition on the ACE inhibition rate of the enzymatic reaction
2.3.2 模型驗證
通過響應面方法的設計，得到酶解富硒核桃的最佳條件為：反應時間為2.52 h，反應底物濃度為5.39%，加酶量為0.33%，預測測得ACE抑制率為78.74%。根據此最佳條件進行驗證實驗，得到酶解富硒核桃反應的實際ACE抑制率為79.13%，高于單因素試驗結果；
實際ACE抑制率與預測ACE抑制率實驗誤差值為0.48%，相近于預測值。因此，利用響應面法對酶解富硒核桃蛋白的酶解工藝優化是穩定可行的。
2.4 酶解物的超濾分離及活性對比分析
經過3 ku超濾膜超濾分離，得到＜3 ku和＞3 ku的組分隨后凍干開展ACE抑制活性研究。使用HEPES緩沖液配制濃度為1 mg/mL的溶液，進行ACE抑制率的測定。由圖10可知，＜3 ku的組分ACE抑制率顯著高于＞3 ku組分，達到77.78%。由此結果可知，分子量相對較小的組分ACE抑制活性也更高，在綿羊乳酪蛋白和馬面魚皮含有的ACE抑制肽中也有類似的結論表明分子量較小的ACE抑制肽其抑制活性越高[13,27]。原因可能是分子質量大的肽段結構相對復雜，具備抑制活性的氨基端沒有暴露，導致ACE抑制作用低[28]。
圖10 超濾分離各組分ACE抑制率Fig.10 Ultrafiltration separation of each component ACE inhibition rate
2.5 氨基酸組成分析
采用陽離子交換色譜柱（LCA K06/Na柱），在流動相為檸檬酸鈉A=0.12 N，pH值3.45和B=0.2 N，pH值10.85，流速為洗脫泵0.45 mL/min+衍生泵 0.25 mL/min，溫度在58 ℃~74 ℃梯度控溫，壓力范圍控制在30 bar~40 bar，進樣量在20 μL的條件下測得波長570 nm與440 nm的曲線與數據如圖11所示。
圖11 氨基酸分析色譜圖Fig.11 Chromatogram for amino acid analysis
根據氨基酸的分析色譜圖可知，檢測到共16種氨基酸，其中包含了7種人體必需氨基酸，含量共26.36%。其中在440 nm波長下檢測到脯氨酸的存在，其含量為2.88%。大多數研究表明在ACE抑制肽中，脯氨酸起著非常重要的作用，其存在使其附近的多肽不易被體內的水解酶降解[29]，所以脯氨酸的存在對保護抑制肽有著重要意義。
其次，有研究表明，ACE抑制肽序列的疏水性和空間特性在生物活性上起著重要作用[30]。由于ACE的C端的結構域包含的3個催化活性位點都有明顯的疏水性[12]，說明其C端結構域是疏水性環境。當底物含有疏水性氨基酸時ACE更傾向于與其結合[16]，可以得出疏水性氨基酸對ACE抑制肽的抑制能力有重 要影響，并且其數量和位置則直接影響多肽的空間結構的形成[31]。由實驗數據可知，樣品中含有的疏水性氨基酸共7種，總含量為27.19%，其豐富的種類與含量可能對ACE抑制肽的高抑制活性具有一定影響。
表5 富硒核桃粕酶解物氨基酸的相對百分含量Table 5 Relative percentages of amino acids in enzymatic digest of selenium-rich walnut meal
2.6 硒含量分析
由表6可得，富硒核桃中的硒含量為1.64 mg/kg，遠大于普通市售核桃的硒含量0.11 mg/kg。酶解物、＜3 ku組分和＞3 ku組分的硒含量分別為0.82 mg/kg、1.35 mg/kg和0.32 mg/kg。這說明富硒核桃中存在于多糖、核酸或沒被完全酶解的蛋白等成分中的約50%的硒元素在酶解后的離心環節中已損失掉[32]。而酶解物中硒元素主要集中在占比較小的＜3 ku的肽組分中，而占比較大的＞3 ku組分中硒含量明顯較低。堿性蛋白酶在制備富硒肽的現有研究中常使用堿性蛋白酶，例如富硒平菇肽[33]與富硒玉米肽[34]的制備。本研究在實驗過程中考慮到堿性蛋白酶酶所得水解物后續需要脫鹽工藝操作，因此選用弱堿性的胰蛋白酶作為工具酶，發現在pH值7.5弱堿性條件下對富硒核桃粕進行酶解，效果相對較好，得到的＜3 ku組分硒濃度接近于富硒核桃粕，同時ACE抑制活性隨著pH值的升高而降低。在富硒大豆[35]研究中發現，利用中性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解得到的富硒大豆低聚肽中硒含量也達到76.39 μg/kg，這說明在弱堿性、中性甚至弱酸性酶解條件下也具有良好的含硒肽段釋放效果。
表6 市售核桃與富硒核桃及其酶解物的硒含量分析Table 6 Analysis of the selenium content of commercially available walnuts and selenium-enriched walnuts and their enzymatic digests
本研究通過蛋白酶篩選，單因素試驗和響應面優化確定了富硒核桃蛋白ACE抑制肽的最優酶解工藝。在此研究基礎上通過超濾分離得到了ACE抑制活性更好的小分子量肽組分，同時對酶解物的氨基酸組成和硒含量進行了分析。本研究首次通過富硒核桃粕制備ACE抑制肽，為富硒核桃粕高值化利用提供了新的研究思路，為食物源性補硒產品的進一步開發利用提供了理論依據。
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