林世穎,江建,陳宏翔,2
隨著第二代高通量測序技術(shù)(next-generation sequencing technology, NGS)的興起,引發(fā)了一場組學(xué)革命,轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)相繼出現(xiàn)。尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)(singlecell RNA-sequencing, scRNA-seq),作為一種革命性的技術(shù),實(shí)現(xiàn)對單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測序,在腫瘤異質(zhì)性、細(xì)胞類型的鑒定和譜系追蹤上提供了新的見解［1］。然而細(xì)胞間相互作用具有時(shí)間和空間上的差異性,因此空間信息的維持對于理解發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)等至關(guān)重要［2］。scRNA-seq在樣本處理時(shí)需要對細(xì)胞進(jìn)行消化分離,導(dǎo)致細(xì)胞空間位置信息的丟失,無法提供基因表達(dá)的空間模式。空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)(spatial transcriptome sequencing)的發(fā)展彌補(bǔ)了這一缺陷,它能直接從完整組織中量化RNA表達(dá),達(dá)成轉(zhuǎn)錄本信息的空間映射［3］。目前,空間轉(zhuǎn)錄組在多種疾病研究中得到應(yīng)用。本文將對空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展、原理及其在皮膚科學(xué)研究的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要分為三大類［4］:①基于激光捕獲顯微切割技術(shù)(lasercapturemicrodissection, LCM)的方法;②基于成像的方法,包括基于原位雜交(insituhybridization, ISH)的方法和基于原位測序(insitusequencing, ISS)的方法;③基于原位捕獲(insitucapturing, ISC)的方法。
1.1基于激光捕獲顯微切割的方法 LCM是在顯微鏡下,使用紫外線或紅外線從組織切片中單獨(dú)分離出單個細(xì)胞或感興趣的區(qū)域,同時(shí)保留細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和空間信息,隨后,可以通過直接RNA-seq或預(yù)先標(biāo)記空間條形碼的多路復(fù)用程序獲取細(xì)胞信息［5-6］(圖1)。2016年,Kruse等［7］介紹了Tomo-seq(RNA tomography sequencing, Tomo-seq),一種利用冷凍切片機(jī)沿著感興趣的軸對胚胎或組織進(jìn)行切片,然后在每個切片上進(jìn)行RNA-seq的技術(shù)。該研究團(tuán)隊(duì)先后在斑馬魚胚胎和受傷后的成年斑馬魚心臟組織上驗(yàn)證了Tomo-seq具有高空間分辨率和全基因組覆蓋率。2017年,Chen等［8］將LCM與scRNA-seq結(jié)合展示了地域位置測序(geographical position sequencing, Geo-seq),Geo-seq的一個獨(dú)特之處是將各個區(qū)域的標(biāo)志基因作為編碼,并通過編碼檢索單個細(xì)胞的位置。
圖1 激光捕獲顯微切割原理
1.2基于成像的方法
1.2.1ISH ISH的基本原理是使用標(biāo)記的探針與感興趣的RNA互補(bǔ)雜交,這種方法使得研究人員能夠在RNA原始位置進(jìn)行定性、定量和可視化分析［9］。這種標(biāo)記的思路可追溯到1969年,Gall等［10］早在那時(shí)就已利用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針可視化核糖體DNA。1982年,Singer等［11］嘗試使用能夠與核酸序列相結(jié)合的熒光核酸探針,實(shí)現(xiàn)了熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH),該技術(shù)提高了檢測分辨率、靈敏度和特異性。在FISH的基礎(chǔ)上,Femino等［12］將FISH和數(shù)字成像顯微鏡結(jié)合以檢測單個RNA分子,并稱為單分子熒光原位雜交(single-molecule fluorescenceinsituhybridization, smFISH)。
然而,由于smFISH需要使用高分辨顯微鏡,受到顯微鏡下的熒光光譜重疊限制,檢測的靶RNA數(shù)量有限。Lubeck等［13］在2014年開發(fā)了seqFISH,通過連續(xù)多輪雜交、成像和探針剝離,可以覆蓋單個細(xì)胞的整個轉(zhuǎn)錄組。2019年,Eng等［14］在seqFISH的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),并將其命名為seqFISH+,與seqFISH 相比,該技術(shù)不僅將成像效率提高了8倍,還解決了光學(xué)擁擠的問題。盡管seqFISH可檢測的基因數(shù)增多,但是其在應(yīng)用過程中,存在價(jià)格昂貴、費(fèi)時(shí)、檢測誤差高、顯微成像時(shí)分子顏色堆疊等問題。為了克服誤差,多重防錯熒光原位雜交(multiplexed error-robust fluorescenceinsituhybridization, MERFISH)使用二進(jìn)制條形碼策略,提高了檢測的質(zhì)量和數(shù)量［15］(圖2)。但是,MERFISH仍存在雜交熒光背景高的問題,Goh等［16］提出split-FISH,采用分裂探針的設(shè)計(jì),降低了脫靶背景熒光和假陽性。
圖2 順序熒光原位雜交(seq-FISH)和多重抗錯誤熒光原位雜交(MERFISH)原理
1.2.2ISS ISS是另一種基于成像的空間轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)。有研究［17-18］基于鎖式探針、滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification, RCA)原理開發(fā)了第一代ISS技術(shù),該方法首先將mRNA在原位逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,隨后鎖式探針可以通過缺口靶向或條形碼靶向的方式與cDNA結(jié)合,探針末端被填補(bǔ)形成一個DNA環(huán),經(jīng)過RCA形成滾環(huán)產(chǎn)物(rolling-circleproduce, RCP),之后對RCP進(jìn)行測序,重復(fù)進(jìn)行連接、成像和洗滌步驟,經(jīng)過多輪測序循環(huán)讀取條形碼序列,對這些序列進(jìn)行解碼最終能得到檢測的mRNA種類(圖3)。通過這種方法能檢測到很小的序列變異,如剪切位點(diǎn)和突變,易于區(qū)分高度相似的序列［19］。
圖3 原位測序原理
但I(xiàn)SS所用到的探針存在特異性差的問題,并且該技術(shù)難以擴(kuò)展到全轉(zhuǎn)錄組,2015年,Lee等［20］開發(fā)了熒光原位測序(fluorescent in situ sequencing, FISSEQ),使用單鏈DNA環(huán)化酶將原位逆轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA進(jìn)行環(huán)化,通過RCA信號放大后進(jìn)行測序,由于其不需要設(shè)計(jì)靶基因,實(shí)現(xiàn)了非靶向RNA原位分析。
1.3基于原位捕獲的方法 ISC是指通過在原位陣列上非靶向地捕獲組織切片中的轉(zhuǎn)錄本來獲取空間位置信息,然后在異位利用NGS測序［21］。2016年,St?hl等［22］開發(fā)了一項(xiàng)新技術(shù),并將其命名為空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)(spatialtranscriptomics,ST),在微陣列載玻片的每個微孔都固定上帶有空間位置信息的條形碼、唯一分子標(biāo)識符(unique molecular identifier,UMI)、poly-dT的標(biāo)簽,微孔直徑為100 μm,中心距為200 μm。然后將成年小鼠嗅球組織切片置于載玻片上,組織透化后,帶有poly-A的mRNA被微孔內(nèi)的寡核苷酸捕獲,隨后在原位進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,最后,使用基于NGS的RNA-seq獲得基因序列,并通過解碼位置信息標(biāo)簽,與組織圖像聯(lián)合,從而實(shí)現(xiàn)可視化分析。這項(xiàng)技術(shù)于2018年被10×Genomics收購,該公司發(fā)布的Visium就是ST的改進(jìn)版本,其斑點(diǎn)的直徑減小到了55 μm,中心距為100 μm,每個微孔能捕獲超過5 000個轉(zhuǎn)錄本,實(shí)現(xiàn)了更高的分辨率和靈敏度(圖4)。
圖4 10×Visium原位陣列捕獲原理
然而,上述使用條形碼寡核苷酸捕獲陣列進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序的技術(shù)由于捕獲點(diǎn)物理尺寸的限制,無法達(dá)到單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞空間分辨率的要求。因此,科學(xué)家們開發(fā)了一種基于磁珠的、在高空間分辨率下測量全基因組表達(dá)的Slide-seq［23-24］。2021年,Stickels等［25］又在Slide-seq的基礎(chǔ)上,報(bào)告了Slide-seq V2技術(shù),對文庫生成、磁珠合成方面進(jìn)行了改進(jìn),大大提高了轉(zhuǎn)錄本的檢測效率。除了磁珠,還有一種通過微流體通道生成空間陣列的技術(shù),稱為DBiT-seq,具有高空間分辨率(10 μm)、出色的數(shù)據(jù)質(zhì)量和高基因組覆蓋率［26］。
盡管基于磁珠和微流體的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的空間映射都接近單細(xì)胞級別,但它們?nèi)圆荒苤苯咏馕鰡渭?xì)胞。為了解決這個問題,Cho等［27］于2021年提出Seq-Scope,與之前的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)相比,Seq-Scope不僅達(dá)到了0.5～0.8 μm的分辨率,還具有出色的mRNA捕獲效率。近期,還報(bào)道了一種sci-Space技術(shù),用于定位細(xì)胞核的mRNA［28］。
總之,空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)多種多樣,并且仍在不斷發(fā)展中,在具體的應(yīng)用場景下應(yīng)根據(jù)不同方法的利弊進(jìn)行選擇(表1)。
表1 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的對比
在實(shí)際應(yīng)用中,空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)通常與其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合,常見的如與scRNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)等結(jié)合。Lohoff等［29］在表征整個小鼠胚胎細(xì)胞類型時(shí),將seqFISH和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜相結(jié)合,對未能通過seqFISH分析的基因的空間表達(dá)進(jìn)行估算,并發(fā)現(xiàn)了在scRNA-seq數(shù)據(jù)中不明顯的細(xì)胞分化軸。近年來,將蛋白質(zhì)組學(xué)與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合也得到發(fā)展和應(yīng)用。2018年,Schulz等［30］提出了一種可以同時(shí)對蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)磷酸化和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行空間測量的成像型質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)(imaging mass cytometry, IMC)。然而由于抗體標(biāo)記數(shù)量有限,限制了IMC的應(yīng)用,2020年,Piehowski等［31］對此提出了改進(jìn)措施,采用了基于芯片的納米微量液滴蛋白處理系統(tǒng)(Nanodroplet Processing in One potfor Trace Samples, nanoPOTS),與LCM結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了以100 μm分辨率繪制大于2 000種蛋白質(zhì)的定量圖譜。除了與其他組學(xué)技術(shù)結(jié)合,現(xiàn)在還提出了將擬時(shí)序分析應(yīng)用到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中,從而對組織水平發(fā)展進(jìn)行動態(tài)觀察［23］。
目前空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已在神經(jīng)科學(xué)、胚胎發(fā)育、腫瘤微環(huán)境等方面得到廣泛應(yīng)用［32-34］,在皮膚病學(xué)中,主要用于皮膚腫瘤與炎癥方面的研究,如黑素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、瘢痕疙瘩、皮膚炎癥等。
3.1黑素瘤 2018年,Thrane等［35］從4例Ⅲc期黑素瘤患者的淋巴結(jié)活檢中獲得了2 200個組織區(qū)域的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并對4種轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行了主成分分析、因子分析和降維分析,顯示了它們之間廣泛的異質(zhì)性,這是空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)首次應(yīng)用到黑素瘤中。
2022年,Nirmal等［36］結(jié)合了高復(fù)雜成像(high-plex imaging)、3D高分辨率顯微鏡和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對原發(fā)性黑素瘤的免疫逃避和免疫編輯機(jī)制進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)隨著癌前狀態(tài)、原位黑素瘤和侵襲性腫瘤的演化過程,由腫瘤、免疫和基質(zhì)細(xì)胞形成的免疫抑制環(huán)境發(fā)生著顯著的變化,涉及到促進(jìn)MHC-Ⅱ、代謝酶IDO1表達(dá)的局部細(xì)胞因子信號和PD1-PDL1介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用。同年,Biermann等［37］開展的一項(xiàng)研究,通過應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、SlideSeqV2技術(shù),比較了黑素瘤腦轉(zhuǎn)移和顱外轉(zhuǎn)移的細(xì)胞形態(tài)、染色體形態(tài)、巨噬細(xì)胞的組成和表達(dá)差異等,發(fā)現(xiàn)黑素瘤腦轉(zhuǎn)移的特征包括癌細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性增加、神經(jīng)元樣分化、CD8+T細(xì)胞功能障礙、髓系細(xì)胞比例增加、巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出促腫瘤表型等,全面地描繪了黑素瘤腦轉(zhuǎn)移的單細(xì)胞圖譜,為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。Plaschka等［38］對人黑素瘤免疫浸潤物的空間和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析,證明了黑素瘤細(xì)胞中的ZEB1轉(zhuǎn)錄因子直接抑制T細(xì)胞趨化因子,包括CXCL10、CCL3、CCL4的分泌,破壞CD8+T細(xì)胞募集,促進(jìn)了黑素瘤的免疫逃逸。他們的研究成果為黑素瘤免疫治療提供了新的可能的靶點(diǎn)。
3.2非黑素瘤皮膚癌 為了研究腫瘤-間質(zhì)界面在基底細(xì)胞癌侵襲過程中的作用,Yerly等［39］首先對5例臨床收集到的浸潤性基底細(xì)胞癌的新鮮活檢組織進(jìn)行scRNA-seq,將cluster C0鑒定為腫瘤細(xì)胞,cluster C1、C2、C3分別代表基底、棘層/顆粒層和毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞。隨后,使用數(shù)字空間分析技術(shù)劃分了24個感興趣區(qū),將每個感興趣區(qū)分為腫瘤感興趣區(qū)和間質(zhì)感興趣區(qū),通過比較浸潤型和結(jié)節(jié)型基底細(xì)胞癌在腫瘤和間質(zhì)中的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEG),利用DEG信號將構(gòu)成腫瘤-間質(zhì)交界面的細(xì)胞亞型鑒定為成纖維細(xì)胞。又使用了擬時(shí)序分析推斷出驅(qū)動腫瘤細(xì)胞發(fā)展的各種基因,其中優(yōu)先表達(dá)的基因INHBA主要產(chǎn)生ActivinA,通過旁分泌形式調(diào)節(jié)控制腫瘤細(xì)胞和侵襲部位中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的相互作用。
鱗狀細(xì)胞癌也是一種常見的非黑素瘤皮膚癌。2020年,Ji等［40］整合了人鱗狀細(xì)胞癌組織的單細(xì)胞和空間數(shù)據(jù),在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了腫瘤特有的角質(zhì)形成細(xì)胞(tumor-specific keratinocyte,TSK),TSK細(xì)胞位于纖維血管壁龕,表達(dá)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)的基因,在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著樞紐作用。
3.3瘢痕疙瘩 Shim等［41］運(yùn)用單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄的綜合分析揭示瘢痕疙瘩的潛在病理機(jī)制。通過對比分析瘢痕疙瘩組織和正常組織的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù),顯示瘢痕疙瘩內(nèi)有成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞,空間轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果顯示與疾病相關(guān)的成纖維細(xì)胞集中在瘢痕疙瘩較深的區(qū)域,主要位于內(nèi)皮周圍,多重免疫熒光共定位表明瘢痕疙瘩內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)激活,ST對配體—受體定位的可視化也為成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間互相串?dāng)_提供了證據(jù)支持。這些共同的結(jié)果表明纖維血管通訊和內(nèi)皮間充質(zhì)激活可能參與了瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制。
3.4皮膚損傷愈合 為了研究傷口再上皮化的分子機(jī)制,Konieczny等［42］運(yùn)用了多模式單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄分析及功能研究,表明在受損上皮細(xì)胞中,RORγt+細(xì)胞衍生的IL-17A是激活HIF1的必要充分條件。首先,作者通過測序?qū)D(zhuǎn)錄本和表位進(jìn)行細(xì)胞索引(cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing, CITE-seq)確定了皮膚駐留的RORγt+細(xì)胞直接促進(jìn)傷口再上皮化。隨后,作者繪制了傷口組織邊緣的ST圖譜,對ST結(jié)果進(jìn)行多模態(tài)交叉分析,并經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RORγt+細(xì)胞分泌的IL-17A與上皮細(xì)胞IL-17RC結(jié)合,通過ERK 1/2-AKT-mTOR激活HIF1α,驅(qū)動傷口上皮細(xì)胞的糖酵解,從而參與傷口的愈合。
近年來,空間轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)本身的不斷改進(jìn)以及與其他技術(shù)的結(jié)合,使它成為一個協(xié)助我們理解細(xì)胞表達(dá)和行為模式、識別生物標(biāo)志物、發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)的有力手段。盡管目前各種空間轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)仍然存在需要改進(jìn)的空間,如技術(shù)難度高、成本昂貴,主流的Visium技術(shù)還未達(dá)到單細(xì)胞水平等,但是基于它在闡明正常皮膚和疾病狀態(tài)下的細(xì)胞類型以及細(xì)胞間相互作用等方面的優(yōu)勢,隨著空間轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)在皮膚疾病的廣泛應(yīng)用,其在皮膚病的早期診斷、治療和預(yù)后上將取得更大的進(jìn)展。
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