羅小芬,謝曉東,趙 超,胡 茜,王永璇,冉芳菲,胡鵬飛,文 明,2,朱二鵬,2*,程振濤,2*
(1.貴州大學動物科學學院,貴陽 550025, 2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室,貴陽 550025,3.盤州市動物疫病預防控制中心,盤州 553500)
支原體通常被認為是已知最小的自我復制生物,廣泛分布在各種宿主中。1961年,美國首次分離出牛支原體(Mycoplasmabovis,Mb),可引起養(yǎng)殖場牛持續(xù)呼吸系統(tǒng)疾病、關節(jié)炎和腱鞘炎,以及犢牛乳腺炎、中耳炎和角膜結膜炎等[1-2]。盡管許多研究者都在努力探索其發(fā)病機制,但目前研究尚不完善。由于支原體無細胞壁,許多抗生素對其無效[3]。2008年,我國首次分離到該病原,隨后我國多個省份陸續(xù)報道牛支原體感染牛肺炎病例[4]。近些年,本研究小組對貴州省規(guī)模養(yǎng)牛場(養(yǎng)殖小區(qū))進行流行病學調(diào)查,發(fā)現(xiàn)疑似感染牛支原體肺炎,并成功分離得到兩株牛支原體,分別命名Mycoplasmabovis-GZ-1、Mycoplasmabovis-GZ-2,表明貴州省存在牛支原體肺炎病例[5]。
許多研究表明支原體表面脂蛋白在感染和器官病變中起重要作用[6]。脂蛋白已被證明在細胞凋亡、ABC轉(zhuǎn)運體操作、菌株毒力多樣性和細胞黏附中發(fā)揮作用[7-12]。已有多項研究證明肺炎支原體的P1和P30蛋白[13],關節(jié)炎支原體的Maa1和Maa2蛋白[14],雞毒原體(Mycoplasmagallisepticum, MG)的GapA和CrmA蛋白在細胞中有黏附作用[15]。也有研究在牛支原體中證明P26、α-烯醇化酶和Vsps家族的成員是黏附蛋白[16-17]。由于與宿主細胞的黏附是宿主定植和感染的先決條件,因此鑒定支原體中的黏附蛋白是了解其發(fā)病機制的重要前提。以上研究表明可以在牛支原體中鑒定黏附蛋白。然而關于Mycoplasmabovis-GZ-2是否存在其他黏附蛋白尚未報道。本研究旨在對Mycoplasmabovis-GZ-2的4個假定蛋白進行表達純化、亞細胞定位和黏附性研究,為該蛋白的后續(xù)深入研究提供參考資料。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 3月齡新西蘭雌性大白兔10只購自貴陽經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)鵬程農(nóng)業(yè)科技有限公司。
1.1.2 菌株與質(zhì)粒Mycoplasmabovis-GZ-2[5]、重組pcold IM27、pcold IM32、pcold IM498、pcold IM663質(zhì)粒、胚胎牛肺細胞(EBL)由貴州大學動物疫病研究所制備;大腸桿菌感受態(tài)細胞DE3(BL21)購自TaKaRa生物有限公司。
1.1.3 主要試劑 His標簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、羊抗鼠IgG-HRP、His標簽單抗、聚丙烯酰胺凝膠試劑盒、5×SDS蛋白上樣緩沖液均購于碧云天生物技術有限公司。Proteo-Extract Transmembrane Protein Extraction Kit購自上海貝博生物有限公司。激光共聚焦平皿購自Nest生物有限公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Dil細胞膜染料,DAPI細胞核染料,胎牛血清,山羊抗兔FITC-IgG二抗,山羊抗兔HRP標記IgG抗體、弗氏佐劑購自Sigma生物有限公司。細胞培養(yǎng)皿、細胞刮購自Corning生物有限公司。Hanks平衡鹽緩沖液購自Bio-Channel生物有限公司。2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA消化液,雙抗(10 000 U·mL-1青霉素,10 000 μg·mL-1鏈霉素),1 g·L-1Ⅰ型膠原酶購自Gibco生物有限公司。
1.2 重組蛋白的原核表達、鑒定及純化
將保存的重組pcold IM27、pcold IM32、pcold IM498、pcold IM663質(zhì)粒菌與空載體pCold Ⅰ 種子菌液復蘇(37 ℃ 170 r·min-1)。按照20%的比例轉(zhuǎn)接至新的200 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp+),OD600 nm達到0.4～0.6時,加入1 mmol·L-1的IPTG,37 ℃誘導表達目的蛋白3 h。全部菌液4 ℃ 8 500 r·min-1離心5 min。PBS洗3次,超聲破碎20 min。4 ℃ 8 500 r·min-1離心30 min,分別取20 μL上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。將上清與鎳柱親和純化,收集5次洗脫液,進行SDS-PAGE分析。具體純化操作步驟按His標簽蛋白純化試劑盒說明書進行。取20 μL上清進行Western blot鑒定,簡要步驟:100 mA恒流濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜3 h,將4個目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜,Anti-His tag鼠源單克隆抗體(1∶1 000)作為一抗,37 ℃ 孵育1 h,TBST洗3次,加入HRP標記羊抗鼠IgG (1∶1 000)酶標二抗,37 ℃孵育1 h,TBST洗滌3次。DAB底物顯色溶液顯色,紅外掃描儀觀察結果。
1.3 重組蛋白多克隆抗體的制備及效價的測定
將純化后的M27、M32、M498、M663蛋白分別與弗氏完全佐劑等體積混合均勻充分乳化,按500 μg·只-1通過頸、背部多點皮下接種試驗兔進行首次免疫(收集免疫前血清作為陰性對照),隨后的兩次免疫接種,用等量的弗氏不完全佐劑混合蛋白,每隔2周進行一次;第三次免疫后7 d,再補免一次,3 d后通過耳緣靜脈采血測定抗體效價,當血清效價達到預期值,則通過心臟采血,制備血清,于-80 ℃凍存。將純化后的4個重組蛋白分別用碳酸鹽包被液稀釋后, 以1 μg·mL-1的包被量包被酶標板,利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 分別檢測4個抗體的效價。
1.4 牛支原體各組分蛋白的制備
取300 mL對數(shù)生長后期的牛支原體新鮮培養(yǎng)物,12 000 r·min-1離心30 min收集菌體,滅菌PBS洗滌3次,加入0.5 mL PBS進行超聲破碎至清亮,得到的產(chǎn)物即為牛支原體總蛋白。按照Proteo-Extract Transmembrane Protein Extraction Kit說明書提取牛支原體的細胞膜和細胞質(zhì)蛋白。簡要步驟如下:按照上述方法收集對數(shù)生長后期的牛支原體,沉淀中加入200 μL預冷試劑A和2 μL蛋白酶抑制劑混勻,再加入2 μL穩(wěn)定劑,高速渦旋振蕩15 s,冰上10～15 min,再次高速渦旋振蕩5 s,4 ℃ 8 200 r·min-1離心5 min。快速將上清吸入另一預冷的干凈離心管,37 ℃水浴5～10 min,37 ℃ 1 200 r·min-1離心5 min,此時溶液分為兩層,上層即為胞質(zhì)蛋白,150～200 μL預冷試劑B稀釋下層相,混勻,冰浴2 min,即為膜蛋白。
1.5 目的蛋白的亞細胞定位
分別取40 μL的牛支原體總蛋白、胞膜蛋白、胞漿蛋白以及4個表達蛋白,與5×蛋白上樣緩沖液混合,100 ℃煮沸5 min,冷卻至室溫,8 000 r·min-1離心2 min,取20 μL上樣,進行SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定,操作步驟見方法“1.2”(一抗為兔抗M27、M32、M498、M663血清抗體)。
1.6 黏附與黏附抑制試驗
1.6.1 激光共聚焦掃描顯微鏡分析 利用激光共聚焦顯微鏡分析M27、M32、M498、M663蛋白及牛支原體對EBL細胞的黏附影響,和目的蛋白多抗黏附抑制影響。具體步驟如下。
黏附試驗:當激光共聚焦平皿中EBL細胞密度長至60%時,4%多聚甲醛固定,分別加入5 μL生長至對數(shù)期的牛支原體(1×109CFU·mL-1)和1 mL含20 μg目的蛋白的PBS,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中分別孵育4和2 h,經(jīng)洗滌除去非黏附目的蛋白和牛支原體,未加蛋白組作為空白對照;黏附抑制試驗:將目的蛋白和牛支原體分別與相應各多抗混合,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min,設立4個蛋白多抗混合組。取200 μL孵育混合物加到生長密度60%的EBL細胞中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。然后在含有細胞的平皿上覆蓋兔抗牛支原體的陽性血清。用抗兔IgG-FITC檢測與細胞結合的抗體。DiI標記細胞膜;DAPI標記細胞核。使用激光掃描共聚焦顯微鏡對免疫熒光進行評估。
1.6.2 流式細胞術分析 待EBL細胞密度在細胞培養(yǎng)皿中長至60%時,加入400 μL生長至對數(shù)期的牛支原體(1×109CFU·mL-1),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜,消化細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,1 000 r·min-1,離心5 min,棄上清,加入一抗、二抗進行孵育(一抗為兔抗牛支原體陽性血清,二抗為山羊抗兔FITC-IgG抗體,陰性對照組以兔陰性血清為一抗),經(jīng)洗滌加入200 μL PBS重懸EBL細胞,加入等量4%多聚甲醛,過300目濾網(wǎng)后用流式細胞儀分析結果;空白對照組不加入牛支原體。黏附抑制試驗中,牛支原體分別先與200 μL兔抗目的蛋白抗體37 ℃孵育30 min,再與EBL細胞黏附,其后具體操作同上。
2.1 重組蛋白的表達及純化
重組pcold IM27、pcold IM32、pcold IM498、pcold IM663質(zhì)粒表達菌(DE3),經(jīng)ITPG誘導,進行SDS-PAGE分析。圖1結果顯示:重組M27、M32、M498、M663蛋白成功表達,大部分存在上清,為可溶性蛋白表達。以His單克隆抗體和兔抗牛支原體陽性血清為一抗對4個重組蛋白進行Western blot鑒定,圖2結果顯示:存在4個重組蛋白的目的條帶,蛋白分子量大小為27、16、19和26 ku。在非變性條件下,用His標簽蛋白純化試劑盒進行純化,圖3結果顯示:利用Image J軟件對SDS-PAGE凝膠電泳條帶進行強度分析,成功純化得到4個重組蛋白。
A. M27;B. M498;C. M32;D. M663;M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1、2. 超聲裂解沉淀;3、4. 超聲裂解上清A. M27; B. M498; C. M32; D. M663; M. Protein marker; 1, 2. Lysate precipitation from ultrasonic lysis; 3, 4. Lysate supernatant from ultrasonic lysis圖1 M27、M32、M498、M663重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of M27, M32, M498, M663 recombinant proteins
A～D. 以His單克隆抗體為一抗的Western blot;E～H. 以 兔抗牛支原體陽性血清為一抗的Western blot;A、E. M27;B、F. M498;C、G. M32;D、H. M663;1. pcold I空載體對照;2. 表達蛋白;M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準A-D. Western blot detection using His monoclonal antibody as the primary antibody; E-H. Western blot detection using rabbit anti Mycoplasma bovis positive serum as the primary antibody; A, E. M27; B, F. M498; C, G. M32; D, H. M663; 1. PCold I empty carrier control; 2. Expressed proteins; M. Protein marker圖2 M27、M32、M498、M663表達蛋白的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of M27, M32, M498, and M663 expressed proteins
A. M27;B. M498;C. M32;D. M663;M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1. 蛋白穿流液;2、3. 蛋白洗滌液;4～9. 洗脫蛋白A. M27; B. M498; C. M32; D. M663; M. Protein marker; 1. Protein transmembrane fluid; 2, 3. Protein washing solution; 4-9. Elution protein圖3 純化后M27、M32、M498、M663蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified M27, M32, M498, and M663 proteins
2.2 重組蛋白多克隆抗體ELISA效價測定
經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定兔抗M27、M32、M498、M663蛋白血清抗體。結果顯示:兔抗M27、M32、M663蛋白高免血清抗體效價高達1∶204 800倍,兔抗M498蛋白高免血清抗體效價達1∶25 600(免疫組/對照組>2.1判為陽性)。
2.3 重組蛋白的亞細胞定位
利用Western blot分析M27、M32、M498、M663蛋白在牛支原體中的亞細胞定位,兔抗M27、M32、M498、M663高免血清為一抗,山羊抗兔HRP標記IgG抗體為二抗,結果如圖4所示,結果顯示:M27、M32、M498均在牛支原體總蛋白、胞膜蛋白與胞質(zhì)蛋白中均出現(xiàn)特異印跡條帶,說明M27、M32、M498蛋白同時存在牛支原體的胞膜組分與細胞質(zhì)組分中。然而,M663在牛支原體提取的細胞膜部分蛋白、細胞質(zhì)部分蛋白和牛支原體總蛋白中沒有檢測到目的條帶。
A. M27;B. M498;C. M32;D. M663;1. 表達蛋白;2. 牛支原體總蛋白;3. 胞膜蛋白;4. 胞質(zhì)蛋白A. M27; B. M498; C. M32; D. M663; 1. Expressed proteins; 2. Total protein of Mycoplasma bovis; 3. Membrane proteins; 4. Cytoplasmic proteins圖4 4個重組蛋白的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of the four recombinant proteins
2.4 激光共聚焦掃描顯微鏡分析
利用激光共聚焦掃描顯微鏡分析M27、M32、M498、M663蛋白(圖5～7)及牛支原體對EBL細胞的黏附試驗和兔抗M27、M32、M498、M663多克隆抗體抑制相應蛋白對EBL細胞的黏附抑制試驗,以及單獨和聯(lián)合作用抑制牛支原體對EBL細胞的黏附抑制試驗(M27、M32、M498、M663蛋白多抗、牛支原體陽性血清為一抗,山羊抗兔FITC-IgG為二抗),DAPI染色后細胞核呈藍色 (EBL細胞),Dil染色后細胞膜呈紅色,綠色則為FITC-IgG熒光標記二抗顯色效果及Image J軟件分析綠色熒光強度。圖5和圖8A結果顯示:牛支原體、M27、M32、M498、M663均能黏附在EBL細胞,圖6和圖8B結果顯示:兔抗M27、M32、M498、M663血清抗體能夠明顯的抑制蛋白M27、M32、M498、M663對EBL細胞的黏附:圖7和圖8C結果顯示:在牛支原體黏附抑制試驗中,通過與牛支原體正常組對照可得,兔抗M27、M32、M498、M663血清抗體能夠抑制牛支原體黏附EBL細胞,4個蛋白兔抗多克隆抗體聯(lián)合對抑制牛支原體黏附EBL細胞的作用比較為明顯,但是牛支原體不是只有這4種黏附蛋白,還有其他黏附蛋白存在。
圖5 激光共聚焦觀察牛支原體、M27、M32、M498、M663對EBL細胞黏附Fig.5 Laser confocal observation of Mycoplasma bovis, M27, M32, M498, M663 adhesion to EBL cells
圖6 激光共聚焦觀察目的蛋白抗血清對M27、M32、M498、M663黏附EBL細胞抑制Fig.6 Laser confocal observation of inhibition of M27, M32, M498, M663 adhesion to EBL cells by target protein antisera
圖7 激光共聚焦觀察目的蛋白抗血清對牛支原體黏附EBL細胞抑制Fig.7 Laser confocal observation of inhibition of Mycoplasma bovis adhesion to EBL cells by target protein antisera
A. 牛支原體、M27、M32、M498、M663對EBL細胞黏附的綠色熒光強度;B. M27、M32、M498、M663蛋白抗血清抑制M27、M32、M498、M663黏附EBL細胞的綠色熒光強度;C. M27、M32、M498、M663蛋白抗血清抑制牛支原體黏附EBL細胞的綠色熒光強度A. The green fluorescence intensity of Mycoplasma bovis, M27, M32, M498, and M663 on EBL cell adhesion; B. The anti-serum of M27, M32, M498, and M663 proteins inhibits the green fluorescence intensity of M27, M32, M498, and M663 adhering to EBL cells; C. M27, M32, M498, M663 protein antiserum inhibits the green fluorescence intensity of Mycoplasma bovis adhesion to EBL cells圖8 免疫熒光-綠色熒光強度分析Fig.8 Immunofluorescence-green fluorescence intensity analysis
2.5 流式細胞術分析
利用流式細胞儀檢測牛支原體對EBL細胞的黏附試驗以及兔抗M27、M32、M498、M663多克隆抗體單獨和聯(lián)合抑制牛支原體對EBL細胞的黏附抑制試驗。圖9結果顯示,與空白對照、陰性對照相比,牛支原體對EBL細胞的黏附率為59.6%,抗M27、M32、M498、M663蛋白血清抑制率分別為59.6%、59.5%、59.6%、33.3%,4個抗蛋白血清聯(lián)合作用牛支原體黏附EBL細胞時,抑制率為53.1%,牛支原體陽性血清的抑制率為51.8%,表明4個蛋白抗血清均能抑制牛支原體對EBL細胞的黏附,但是牛支原體不是只有這4種黏附蛋白,還有其他黏附蛋白存在。
(圖9續(xù) Continued)A. 牛支原體對EBL細胞的黏附;B. 抗M27血清對牛支原體黏附EBL細胞的抑制;C. 抗M32血清對牛支原體黏附EBL細胞的抑制;D. 抗M498血清對牛支原體黏附EBL細胞的抑制;E. 抗M663血清對牛支原體黏附EBL細胞的抑制;F. 抗M27、M32、M498、M663血清聯(lián)合作用對牛支原體黏附EBL細胞的抑制;G. 牛支原體陽性血清對牛支原體黏附EBL細胞的抑制;H. 空白對照;I. 陰性對照A. Adhesion of Mycoplasma bovis to EBL cells; B. Inhibition of Mycoplasma bovis adhesion to EBL cells by anti M27 serum; C. Inhibition of Mycoplasma bovis adhesion to EBL cells by anti M32 serum; D. Inhibition of Mycoplasma bovis adhesion to EBL cells by anti M498 serum; E. Inhibition of Mycoplasma bovis adhesion to EBL cells by anti M663 serum; F. The combined effect of anti M27, M32, M498, and M663 serum on the adhesion of Mycoplasma bovis to EBL cells; G. Inhibition of Mycoplasma bovis positive serum on Mycoplasma bovis adhesion to EBL cells; H. Blank control; I. Negative control圖9 牛支原體對EBL細胞的黏附與抗M27、M32、M498、M663血清單獨以及聯(lián)合作用對該黏附的抑制Fig.9 Adhesion of Mycoplasma bovis to EBL cells and inhibition of this adhesion by anti-M27, M32, M498, and M663 sera alone and in combination
牛支原體是引起飼養(yǎng)場奶牛和犢牛慢性肺炎的重要病原體[18]。由于抗生素治療的結果不太理想,這種原核生物給全世界的養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[19]。牛支原體被發(fā)現(xiàn)至今已有60余年,但其致病和免疫機制研究目前尚不完善[20]。牛支原體無細胞壁,直接與宿主細胞相互作用,獲取營養(yǎng)物質(zhì)依賴于許多特征不明的膜相關蛋白。由于對易感宿主細胞的黏附是許多細菌定植和感染的先決條件,因此目前的研究主要集中在支原體的膜蛋白黏附成分上。迄今為止,已有多種牛支原體的相關黏附蛋白獲得鑒定,如P27[21]、MBOV_0503[22]、mbfN[23]等黏附有關的膜蛋白。這些發(fā)現(xiàn)對加強牛支原體對宿主細胞的黏附能力及闡明牛支原體的毒力因素和致病機制有一定的影響。
有研究通過免疫蛋白組學方法鑒定出相關膜蛋白具有很好免疫原性,探索蛋白在牛支原體細胞中的分布及其是否具有免疫原性,對其克隆表達是基礎[24-26]。也有研究利用Western blot成功鑒定雞毒支原體rP25、rP33膜蛋白,并證實其具有黏附性[27];還有研究也利用Western blot成功鑒定牛支原體NOX2蛋白為牛支原體膜蛋白組成成分[28]。綜上所述,原核表達及純化,操作技術簡單且易獲得大量蛋白、Western blot進行膜定位、激光共聚焦和流式細胞術進行黏附性分析,鑒定技術傳統(tǒng)且操作簡單,在一定程度上增加了數(shù)據(jù)結果的科學性和展示的直觀性。因此,本研究通過對牛支原體貴州株全基因組中的假定蛋白進行原核表達及純化、亞細胞定位和黏附性研究,發(fā)現(xiàn)M27、M32和M498蛋白免疫原性良好,其特異性血清抗體能與牛支原體膜蛋白成分發(fā)生特異性反應,均為牛支原體黏附相關蛋白。但M663蛋白血清抗體雖未與牛支原體膜蛋白發(fā)生特異性反應,M663蛋白及其血清抗體仍能夠黏附EBL細胞和抑制牛支原體對EBL細胞的黏附。本研究經(jīng)過反復試驗,結果也是如此,目前可能原因是M663蛋白在牛支原體表達量較低,不足以達到Western blot 檢測所需含量,可通過該蛋白的過表達來進一步驗證其蛋白屬性,但具體原因尚且不知,需進一步試驗驗證。此外,流式細胞儀觀察結果和激光共聚焦觀察結果均顯示M498、M663蛋白均能黏附EBL細胞,對牛支原體有一定的抑制作用。其中M663蛋白膜定位的Western blot 檢測呈陰性,但仍具有抑制支原體的黏附性,可能是因為Western blot與免疫熒光試驗和流式細胞術中的抗原-抗體反應特性和靈敏度有差異。在牛支原體膜蛋白黏附研究中,單一蛋白可能并不發(fā)揮黏附作用或不會影響牛支原體的黏附,而是通過多種蛋白協(xié)同作用才發(fā)揮黏附作用和影響牛支原體黏附功能;M663蛋白也可能作為一種協(xié)同蛋白參與牛支原體黏附[29]。本文對M27、M32、M498、M663蛋白的功能初步驗證,為后期研究該蛋白的深入研究奠定一定的基礎及防控牛支原體貴州株提供了科學依據(jù)。
本研究表明,M27、M32 、M498是牛支原體的黏附相關蛋白。雖然M663在Western blot鑒定中未檢測到,但具有黏附性,且其抗血清能夠抑制牛支原體對EBL細胞的黏附,這一發(fā)現(xiàn)值得深入研究,并可能為了解牛支原體黏附宿主細胞的作用機制提供科學依據(jù)。
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