楊立強，劉彥斌，茍金明，王吉祥，劉 凱，肖 偉，王永杰，楊瑞蘭，柳 婷，劉 哲，連總強
(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070；
2.寧夏回族自治區水產研究所，銀川 750001；
3.寧夏漁業工程技術研究中心，銀川 750001；
4.喀什大學生命與地理科學學院，**喀什 844000；
5.寧夏回族自治區水產技術推廣站，銀川 750001)
本研究利用線粒體細胞色素C氧化酶I(COX1)基因序列和線粒體NADH脫氫酶第一亞基(ND1)基因序列，初步研究了黃河上游3個不同地理群體大鼻吻的遺傳多樣性，探討其群體關系及系統地位，為大鼻吻遺傳資源保護和利用提供參考依據。
1.1 材料
圖1 大鼻吻采樣水域Fig.1 Sampling location map of R. nasutus
1.2 基因組DNA提取
采用血液/細胞/組織DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取大鼻吻樣本基因組DNA。采用Nano-30核酸濃度測定儀(杭州奧盛儀器有限公司)檢測濃度及OD值，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性后，于-20 ℃保存備用。
1.3 PCR擴增及測序
用于擴增目的片段COX1和ND1的引物序列分別為：COX1F：5′-TTTATCTTGTATTTGGTGC-3′和R：5′-CTTCAGAAGAAAGTGACAGAGTGGT-3′；
ND1F：5′-ATACTGGGGTGGCAGAGCA-3′和R：5′-GGCGA AGGTTAGGGTGGTT-3′。大鼻吻線粒體基因COX1和ND1的PCR反應體系均為30 μL，其中，正反向引物各1 μL(10 pmol/μL)，DNA樣本 1 μL(50 ng)，Premix 2×Taq(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)15 μL，ddH2O 12 μL。PCR 反應程序為94 ℃預變性5 min；
94 ℃變性30 min，兩基因退火溫度分別為COX1 55 ℃、ND1 51 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；
72 ℃終延伸10 min，產物4 ℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測合格的樣品送上海生工生物有限公司測序，測序引物與PCR擴增引物相同。
1.4 數據分析
利用DNASTAR Lasergene 11 Core Suite軟件包中的SeqMan Pro軟件對測序所得的原始序列峰圖進行人工分析校對[9]。將合格的堿基序列采用Bioedit.exe軟件進行多重對比，參照吻(GenBank登錄號：NC 0244232.1)線粒體COX1和ND1基因序列，經人工校對、剪切后，保留同等長度的有效片段用于進一步分析[10]。通過MEGA 10.0統計COX1和ND1基因序列各堿基組成、保守位點、變異位點、簡約信息位點及單突變位點，同時基于Kimura-2-parameter(雙參數)模型計算兩兩群體之間的遺傳距離(D)，并用鄰近法(Neighbor Joining，NJ)構建系統進化樹[11]。采用DnaSP v6軟件計算各群體單倍型數、變異位點數、單倍型多態(Hd)、核苷酸多態性(π)以及平均核苷酸差異(K)[12]等遺傳多樣性參數。Arlequin 3.0軟件[13]進行群體間遺傳分化指數檢驗和Tajima′sD中性檢驗及遺傳變異分析。采用NETWORK 10.0軟件來構建線粒體COX1和ND1基因序列的單倍型網絡結構圖[14]。
2.1 堿基組成及與序列變異
將分別測得的145條COX1、ND1序列進行比對，各群體堿基組成見表1。結果表明COX1序列長度為1 466 bp，變異位點11個，占全序列的0.75%，其中簡約信息位點7個，單突變位點4個，分別占全序列的0.47%，0.27%。145條COX1序列中A、T、C、G堿基的平均含量分別為27.40%、29.85%、24.77%、17.98%；
ND1序列的長度為975 bp，變異位點8個，占全序列的0.82%，其中簡約信息位點7個，單突變位點1個，分別占全序列的0.72%，0.10%。145條ND1序列中A、T、C、G堿基的平均含量分別為29.22%、27.59%、27.90%、15.29%。由此可知，大鼻吻線粒體COX1、ND1基因在堿基組成上存在一定差異，但均具有明顯的A/T堿基組成偏向性，這一特征與其他硬骨魚類相類似[15]。
表1 基于線粒體DNA COX1和ND1序列的堿基組成Tab.1 Base competition based on mtDNA COX1 and ND1 sequences %
2.2 遺傳多樣性
在145條COX1基因序列中，共定義了20個單倍型，各群體單倍型多樣度及核苷酸多樣度見表2。由表2可知，大鼻吻YN群體單倍型多態性最高(Hd=0.764)，PL群體單倍型多態性最低(Hd=0.709)。PL群體核苷酸多態性最高(π=0.001 32)，YN群體核苷酸多態性最低(π=0.001 22)；
在145條ND1基因序列中，共定義了17個單倍型，各群體單倍型多樣度及核苷酸多樣度見表3。由表3可知，大鼻吻PL群體單倍型多態性最高(Hd=0.443)，YN群體單倍型多態性最低(Hd=0.288)。PL群體核苷酸多態性最高(π=0.000 63)，YN群體核苷酸多態性最低(π=0.000 31)。
表2 基于線粒體DNA COX1序列的3個大鼻吻群體的遺傳信息Tab.2 Genetic information of three populations of R.nasutus based on mitochondrial DNA COX1 gene
表2 基于線粒體DNA COX1序列的3個大鼻吻群體的遺傳信息Tab.2 Genetic information of three populations of R.nasutus based on mitochondrial DNA COX1 gene
群體樣本量單倍型數單倍型多態性核苷酸多態性平均核苷酸差異YN3250.7640.001 221.786PL4650.7090.001 321.933DK67100.7630.001 231.800
表3 基于線粒體DNA ND1序列的3個大鼻吻群體的遺傳信息Tab.3 Genetic information of three populations of R.nasutus based on mitochondrial DNA ND1 gene
表3 基于線粒體DNA ND1序列的3個大鼻吻群體的遺傳信息Tab.3 Genetic information of three populations of R.nasutus based on mitochondrial DNA ND1 gene
群體樣本量單倍型數單倍型多態性核苷酸多態性平均核苷酸差異YN3240.2880.000 310.304PL4650.4430.000 630.617DK6780.3720.000 510.494
基于COX1基因序列共檢測出11個單倍型，其中Hap1、Hap2、Hap3、Hap4為3個群體共享單倍型，占總數的36.36%；
其余的均為單一單倍型，占總數的63.64%。Hap5是YN群體特有的單倍型；
Hap6為YN群體和PL群體共享單倍型；
Hap7、Hap8、Hap9、Hap10、Hap11為DK群體所獨有；
基于ND1基因序列共定義了9個單倍型，其中Hap1，Hap2為3個群體共享單倍型，占總數的22.22%；
Hap3和Hap4為YN群體和PL群體共享單倍型，占總數的22.22%；
Hap5為PL群體和DK群體共享單倍型，占總數的11.11%；
其余的均為DK群體所特有的單一單倍型，占總數的44.44%。
2.3 遺傳距離與遺傳分化
基于COX1基因序列的Kimura雙參數模型(Boot-strap=1 000)的遺傳距離見表4。由此可知，大鼻吻3個群體組間遺傳距離相同，組內遺傳距離為0.001 22～0.001 32，組內遺傳距離接近組間遺傳距離；
基于ND1基因序列的Kimura雙參數模型(Boot-strap=1 000)遺傳距離見表5。由此可知，大鼻吻3個群體組間遺傳距離為0.000 41～0.000 558，群體間遺傳距離接近。組內遺傳距離為0.000 44～0.000 73，組內遺傳距離接近組間遺傳距離。
表4 基于COX1序列的大鼻吻群體間的遺傳距離D和遺傳分化指數FstTab.4 Genetic distance D and genetic differentiation index Fst among populations of R.nasutus based on COX1 sequence
表4 基于COX1序列的大鼻吻群體間的遺傳距離D和遺傳分化指數FstTab.4 Genetic distance D and genetic differentiation index Fst among populations of R.nasutus based on COX1 sequence
群體YN PLDKYN0.001220.001300.00130PL0.001200.001320.00130DK0.07655*0.020770.00131
注:對角線為群體內遺傳距離D； 表5 基于ND1序列的大鼻吻群體間的遺傳距離D和遺傳分化指數FstTab.5 Genetic distance D and genetic differentiation index Fst among populations of R.nasutus based on ND1 sequence 表5 基于ND1序列的大鼻吻群體間的遺傳距離D和遺傳分化指數FstTab.5 Genetic distance D and genetic differentiation index Fst among populations of R.nasutus based on ND1 sequence 群體YN PLDKYN0.000 440.000 470.000 41PL0.003 740.000 730.000 58DK0.003 590.008 350.000 67 基于COX1基因序列的大鼻吻群體間遺傳分化指數見表4。結果顯示，大鼻吻3個群體組間遺傳分化指數為0.001 20～0.076 55，YN群體與DK群體間的遺傳分化指數最大(0.076 55)，YN群體與PL群體的遺傳分化指數最小(0.001 20)； 基于COX1基因序列的分子方差(AMOVA)分析結果見表6，結果顯示，大鼻吻3個群體的群體內遺傳變異占96.52%，群體間的遺傳變異占3.48%； 表6 大鼻吻群體間分子變異分析Tab.6 Analysis of molecular variance(AMOVA) among R.nasutus populations 表6 大鼻吻群體間分子變異分析Tab.6 Analysis of molecular variance(AMOVA) among R.nasutus populations 變異來源基因自由度平方和變異組成變異百分比/%群體間COX124.8990.033 12 Va3.48ND120.6830.000 45 Va0.14群體內COX1142130.5900.919 65 Vb96.52ND114245.720.320 96 Vb99.96總計COX1144135.4900.952 77ND114446.2550.321 38固定指數(Fst)COX10.034 76*ND10.001 40 注:*表示差異顯著(0.01 基于線粒體COX1和ND1基因的單倍型序列,以吻(GenBank登錄號:NC 0244232.1)、圓筒吻(GenBank登錄號:KU 379652.1)、長鰭吻(GenBank登錄號:KU 379653.1)為外群,用鄰近法(Neighbor Joining,NJ)構建系統發育樹(圖2和圖3)。結果顯示,大鼻吻3個地理群體的單倍型均無明顯的譜系分化,未發現構成一個單獨的分支的群體。 圖2 基于線粒體DNA COX1基因的單倍型NJ系統樹Fig.2 Haplotype NJ system tree based on mitochondrial DNA COX1genes 圖3 基于線粒體DNA ND1基因的單倍型NJ系統樹Fig.3 Haplotype NJ system tree based on mitochondrial DNA ND1 genes 基于COX1基因序列的單倍型網絡圖見圖4，結果顯示，大鼻吻3個群體共鑒定出11個單倍型，11個單倍型無明顯的支系劃分，結果與NJ進化樹一致。圖中每個不同顏色代表不同的群體，每個圓圈代表一種單倍型，圓圈的面積大小表示其頻率的高低。圓圈之間的連接線表示突發事件； 圖4 基于線粒體DNA COX1序列的大鼻吻單倍型網絡圖Fig.4 Network of R.nasutus based on concatenated DNA COX1 sequences haplotypes 圖5 基于線粒體DNA ND1序列的大鼻吻單倍型網絡圖Fig.5 Network of R.nasutus based on concatenated DNA ND1 sequences haplotypes 基于COX1和ND1基因序列的中性檢驗結果顯示見表7。鑒于大鼻吻3個地理群體間的遺傳距離較小、遺傳分化程度較弱，故分析其歷史動態信息時將3個群體作為一個整體進行分析，COX1和ND1基因序列總體的中性檢驗結果表明Tajima′sD和Fu′sFs值均為負值，P值也均不顯著，說明大鼻吻群體符合中性進化?；贑OX1和ND1基因序列的3個大鼻吻群體增長均服從constant模型，核苷酸不配對分布曲線均呈現單峰形(圖6和圖7)，表明大鼻吻近期可能經歷了群體擴張過程。 表7 大鼻吻群體COX1和ND1基因的中性檢驗Tab.7 Neutrality test of COX1 and ND1 genes in R.nasutus populations 表7 大鼻吻群體COX1和ND1基因的中性檢驗Tab.7 Neutrality test of COX1 and ND1 genes in R.nasutus populations 基因群體Tajima"sDTajima"sD P-valueFu"sFsFu"sFsP-valueCOX1YN2.015 360.979 001.062 590.720 00PL1.077 760.888 001.837 810.833 00DK-1.291 500.063 00-5.350 450.214 00總體0.600 540.643 33-5.816 680.524 00ND1YN-1.366 720.068 00-2.306 060.015 00PL-1.128 130.103 00-1.494 320.171 00DK-1.517 120.030 00-4.590 640.002 00總體-1.337 320.067 00-2.796 950.062 67 圖6 基于COX1 基因序列的大鼻吻群體錯位分布圖Fig.6 Dislocation distribution map of R.nasutus major population based on COX1 gene sequencesA表示YN群體； 圖7 基于ND1基因序列的大鼻吻群體錯位分布圖Fig.7 Dislocation distribution map of R.nasutus major population based on ND1 gene sequencesA表示YN群體； 遺傳多樣性是物種進化和適應性的基礎，遺傳多樣性水平可有效反映物種對環境適應能力的大小，遺傳多樣性水平越低表明該物種面臨資源衰退甚至瀕臨滅絕，反之則意味著該物種對環境的適應能力越強[16-18]。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)作為衡量一個物種群體多樣性的兩個重要指標，通常被用來評價群體遺傳多樣性水平的高低[19，20]。由于核苷酸多樣性(π)考慮了各種線粒體DNA單倍型在群體中所占的比例，因此更能準確反映群體的遺傳多樣性，π值越高則說明群體的遺傳多樣性較高[21]。根據GRANT等[22]制定的以單倍型多樣性Hd=0.5和核苷酸多樣性π=0.005為界的分類標準，本研究中，基于COX1基因的三個群體均呈現高單倍型多樣度(Hd>0.5)低核苷酸多樣度(π<0.005)的狀態，其原因可能是一個較小的種群在快速進化過程中，種群數量增加的同時單倍型多樣度也在提高，但無足夠時間使得核苷酸發生變異[23，24]?；贜D1基因的3個群體均呈現低單倍型多樣度(Hd>0.5)低核苷酸多樣度(π<0.005)的狀態，表明此小群體并未出現快速進化的過程，亦未發生明顯的核苷酸變異。造成兩種基因差異的原因可能是，由于基因序列差異，導致遺傳多樣性的大小存在一定的差異，這可能與線粒體DNA不同序列的基因長度不同以及保守性差別有關[25]。對比同屬黃河上游分布的極邊扁咽齒魚[26](Platypharodonextremus)(Hd為0.993～1.000，π為0.0107～0.0158)和花斑裸鯉[27](Gymncypriseckloni)(Hd為0.75～0.89，π為0.06～0.11)，大鼻吻遺傳多樣性表現出較低的水平。推測可能是黃河干流水利水電設施建設，洄游通道被阻斷，加之歷史上過度捕撈、水域污染以及周圍環境的破碎化等因素，導致大鼻吻種質資源數量大幅度下降[28]，出現瓶頸效應，從而使得群體遺傳多樣性水平下降。因此，為了有效恢復其種群大小及遺傳多樣性水平，必須加強對現有野生資源的科學管理和保護。 群體間的遺傳距離(D)和遺傳分化指數(Fst)通常用來衡量兩個群體間的遺傳分化程度，其值越大，表明群體分化程度越高[33]。根據NEI[30]制定的以遺傳距離0.05、0.02為界的分類標準，本研究中，基于3個不同地理群體的線粒體COX1和ND1基因序列分析，群體間的遺傳距離均在0～0.5之間，符合同一物種不同群體間遺傳距離變動規律，且3個群體之間的遺傳距離均處于同一水平，說明各群體之間在基因交流上沒有受到影響。根據BALLOUX等[31]制定的以遺傳分化指數0.05、0.15和0.25為界的分類標準，本研究基于3個地理群體的線粒體COX1基因序列分析，YN和DK兩群體之間遺傳分化指數(0.076 55)處于中等遺傳分化水平，其余群體間的遺傳分化指數均在0～0.05之間，處于低等分化水平。而ND1基因序列中群體間的遺傳分化指數均在0～0.05之間，表明群體遺傳分化水平較低。通過線粒體不同基因序列所得出3個群體的遺傳距離和遺傳分化指數結果不同，這可能與COX1和ND1基因的進化速率的大小有關。同時，大鼻吻群體間及群體內的AMOVA分析結果也表明，大鼻吻的遺傳變異主要來自群體內，只有少量來自群體間。基于COX1基因和ND1序列構建的NJ樹中，3個群體的單倍型相互混雜，未發生明顯譜系分化，這些結果均表明3個群體沒有顯著的遺傳分化，遺傳分化較小的特點。推測出現這種現象與環境的脅迫對群體的遺傳結構會產生較大影響[32]，以及繁殖習性有關：本研究中3個群體分布于黃河上游河段，河流處于貫通狀態，其氣候、溫度和鹽度等環境因素都大致相同，嚴格意義上3個群體并未形成地理隔離； 綜上所述，本研究基于COX1和ND1基因序列對中國黃河上游YN、PL和DK 3個不同地理群體的大鼻吻進行了遺傳多樣性分析。結果表明，大鼻吻3個群體的親緣關系較近，無明顯譜系分化，結構比較單一，未發現構成一個單獨分支的群體；
對角線左下方表示群體間分化指數Fst；
對角線右上方表示群體間遺傳距離D；
*表示差異顯著(0.01
基于ND1基因序列的大鼻吻群體間遺傳分化指數見表5。結果顯示，大鼻吻3個群體組間遺傳分化指數為0.003 59～0.008 35，PL群體與DK群體間的遺傳分化指數最大(0.008 35)，YN群體與DK群體的遺傳分化指數最小(0.003 59)。
基于ND1基因序列的分子方差(AMOVA)分析結果見表6，結果顯示，3個群體的大鼻吻群體內遺傳變異占99.96%，群體間的遺傳變異占0.14%。
2.4 系統發育關系
單倍型網絡圖是以高頻率優勢單倍型H1、H2、H3、H4為中心，低頻單倍型以網狀圍繞在其周圍，表明大鼻吻3個群體遺傳結構較為簡單；
基于ND1基因序列的單倍型網絡圖見圖4，結果顯示，大鼻吻3個群體共鑒定出9個單倍型，9個單倍型無明顯的支系劃分，結果與NJ進化樹一致。單倍型網絡圖是以高頻率優勢單倍型H1為中心，低頻單倍型以星狀圍繞在其周圍，亦表明大鼻吻3個群體遺傳結構較為簡單。
2.5 群體歷史動態分析
B表示PL群體；
C表示DK群體；
D表示總體
B表示PL群體；
C表示DK群體；
D表示總體3.1 遺傳多樣性
3.2 群體遺傳分化
而大鼻吻作為一種典型的半洄游性魚類，在每年繁殖期，其性成熟個體溯河洄游至黃河上游的急流淺灘處產卵，受精卵孵化過程貫穿于中游至上游河段，促進了種群的擴散，使得大鼻吻整體上呈現出遺傳分化弱的現象。這與亞科魚類的蛇[33](Saurogobiodabryi)、圓筒吻[34]和長鰭吻[35]等的報道結果相似。鑒于3個群體之間及群體內部的遺傳分化水平較低且遺傳距離相近,因此,建議將大鼻吻作為一個整體進行就地保護。3.3 保護建議
從COX1基因序列來看，大鼻吻3個群體遺傳多樣性處于較高水平。從ND1基因序列來看，大鼻吻3個群體遺傳多樣性處于較低水平；
大鼻吻3個群體的遺傳變異主要來自于群體內部；
中性檢驗結果表明大鼻吻進化歷程符合中性進化假設，且存在群體擴張可能。因此，建議將大鼻吻3個群體作為一個整體加強對大鼻吻群體的保護，設立有效的保護措施，加大宣傳保護力度，主要加強就地保護，改善其棲息環境，逐步完善對大鼻吻群體的保護措施，使得其種質資源得到有效的恢復。