劉肖，張麗華，張旺，楊靜，趙莉莉，王采寧
2型糖尿病（T2DM）是最主要的糖尿病類型，約占所有糖尿病的95%[1]。有研究證明，T2DM可通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移影響乳腺癌（BCa）發(fā)病率和預(yù)后，其中脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)（fat mass and obesity-associated,FTO）基因多態(tài)性在T2DM作用過程中起重要修飾作用[2]。另外，T2DM通常伴隨著慢性炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等狀態(tài)，同樣影響了BCa發(fā)病率和預(yù)后。其中白細(xì)胞介素-6（IL-6）和由熱休克蛋白（HSP）D1編碼的HSP-60基因多態(tài)性分別在上述過程中起到重要修飾作用[3-5]。然而，目前國(guó)內(nèi)尚無關(guān)于T2DM患者上述基因多態(tài)性同BCa發(fā)病率和預(yù)后相關(guān)性的研究。
本試驗(yàn)從FTO、IL-6、HSP-60三種基因中分別選擇一個(gè)潛在功能性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)，即FTO rs3751812、IL-6 rs1800796和HSP-60 rs2605039，分析其同T2DM患者BCa發(fā)病率和預(yù)后的相關(guān)性，以期解釋基因多態(tài)性的相關(guān)修飾作用，同時(shí)為BCa發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后預(yù)測(cè)研究提供新的思路和參考。
1.1 患者資料
篩選2016年8月至2021年10月于唐山市人民醫(yī)院和開灤總醫(yī)院接受診療的BCa患者1 551例（試驗(yàn)組），以及上述兩家醫(yī)院同年齡層次接受健康體檢的女性1 605例（對(duì)照組），共3 156例試驗(yàn)參與者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在唐山地區(qū)居住至少5年；
（2）未患有其他惡性腫瘤。排除拒絕接受基線資料調(diào)研問卷或血樣采集者。本試驗(yàn)通過唐山市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：202203034），所有試驗(yàn)參與者均簽署知情同意書。基線資料調(diào)研問卷內(nèi)容包括：年齡、受教育程度、婚姻狀態(tài)、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、初次月經(jīng)年齡、月經(jīng)狀態(tài)、停經(jīng)年齡、哺乳史、BCa家族史、糖尿病史。
1.2 血樣采集
參與者禁食禁水12 h后，于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，采用EDTA-K2抗凝管（美國(guó)BD公司）采集外周靜脈血5 ml并使其同肝素抗凝劑充分混勻，3 000 r/min離心5 min，于血漿中加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，振蕩混勻3 min充分裂解紅細(xì)胞。8 000 r/min離心1 min沉淀白細(xì)胞。按照操作說明書，采用Invitrogen全血基因組DNA提取試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾公司）提取DNA并放置于-80℃冰箱保存，用于分析SNP基因型。
1.3 基因檢測(cè)
采用NanoDrop ONEC超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）檢測(cè)DNA濃度和純度。采用MassARRAY SNP基因型分析儀（美國(guó)Sequenom公司）檢測(cè)三種基因SNP分型。根據(jù)NCBI gene數(shù)據(jù)庫檢索FTO rs3751812、IL-6 rs1800796和HSP-60 rs2605039三種SNP位點(diǎn)序列。采用Geno typing Tools和MassARRAYAssay Design軟件設(shè)計(jì)三種SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物和延伸引物（美國(guó)Sigma公司），引物詳情見表1。然后，采用Takara Taq酶（美國(guó)賽默飛世爾公司）在MassARRAY質(zhì)譜儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，結(jié)束后將PCR產(chǎn)物再次進(jìn)行純化、擴(kuò)增。最后，采用MassARRAY RS 1000軟件進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果見圖1。
圖1 1 551例試驗(yàn)組乳腺癌患者高通量測(cè)序結(jié)果Figure 1 High-throughput sequencing result of 1551 patients with breast cancer in the experiment group
表1 三種SNP位點(diǎn)引物序列Table 1 Primer sequences of three SNP loci
1.4 隨訪
對(duì)1 551例BCa患者進(jìn)行電話隨訪。第一年至少每3個(gè)月進(jìn)行一次隨訪，第二、三年至少每6個(gè)月進(jìn)行一次隨訪，第四年開始每年進(jìn)行一次隨訪，隨訪截至2021年12月。患者總體生存期（OS）定義為由診療開始至死亡時(shí)間，共獲得有效隨訪結(jié)果1 168例。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
使用SPSS19.0軟件，試驗(yàn)組同對(duì)照組基線資料中不符合正態(tài)分布的分類資料以n（%）描述，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)；
符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以描述，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg遺傳平衡性采用卡方檢驗(yàn)。以對(duì)照組三種SNP位點(diǎn)基因型分布和T2DW發(fā)病率為期望值，采用擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)組三種SNP位點(diǎn)基因型分布和T2DW發(fā)病率。采用單、多因素Logistic逐步回歸分析T2DM患者三種SNP對(duì)BCa發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用Kaplan-Meier法繪制BCa患者OS曲線。全部結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 試驗(yàn)組和對(duì)照組人群臨床資料
試驗(yàn)組和對(duì)照組除受教育程度和月經(jīng)狀態(tài)以外，其他各項(xiàng)臨床資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCa患者受教育程度較低（P=0.032），且絕經(jīng)前發(fā)病率較高（P=0.018），見表2。
表2 試驗(yàn)組和對(duì)照組臨床資料Table 2 Clinical data of experiment and control groups
2.2 基因分型
3 156例試驗(yàn)參與者基因分型和T2DM結(jié)果見表3。其中FTO rs3751812（GG）、IL-6 rs1800796（CC）、HSP-60 rs2605039（GG）為野生純合子，其他為突變雜合子或突變純合子，GT+TT、CG+GG、GT+TT分別為顯性模型下相應(yīng)暴露組。三種基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（HWE均P>0.05）。試驗(yàn)組與對(duì)照組基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），三種SNP在兩組中均勻分布；
試驗(yàn)組T2DM發(fā)病率顯著高于對(duì)照組（P=0.047），見表3。單從基因型分布上，無法利用三種SNP對(duì)BCa發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。
表3 試驗(yàn)組和對(duì)照組基因分型分布和T2DM發(fā)病情況(n(%))Table 3 Genotyping and T2DM results of experiment and control groups (n(%))
2.3 BCa發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)
基于T2DM發(fā)病情況，對(duì)BCa發(fā)病率行單、多因素Logistic逐步回歸分析。野生純合子FTO rs3751812GG、IL-6 rs1800796CC和HSP-60 rs2605039GG型的T2DM女性BCa發(fā)病率顯著高于非T2DM女性，是影響B(tài)Ca發(fā)病率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（均P<0.05），分別導(dǎo)致BCa發(fā)病率提高了4.332、3.764和2.255倍，見表4、5。
表4 單因素Logistic逐步回歸分析試驗(yàn)組和對(duì)照組基因分型分布對(duì)T2DM患者BCa發(fā)病率的影響Table 4 Univariate logistic stepwise regression analysis of effect of genotyping on BCa incidence in T2DM patients in experiment and control groups
2.4 生存分析
根據(jù)三種SNP和T2DM繪制BCa患者OS曲線見圖2。其中根據(jù)FTO rs3751812、IL-6 rs1800796和T2DM繪制的OS曲線無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.470,0.183,0.556），根據(jù)HSP-60 rs2605039繪制的OS曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031）。HSP-60 rs2605039暴露組基因型（GT+TT）的患者OS顯著優(yōu)于基因型為野生純合子GG的患者。
圖2 三種SNP分型和T2DM對(duì)BCa患者OS的影響Figure 2 Effect of three SNPs and T2DM on OS of patients with BCa
T2DM是一種常見疾病，可通過多種途徑影響B(tài)Ca的發(fā)病率和預(yù)后。大量研究證明[6-10]，T2DM女性患者BCa發(fā)病率顯著升高。隨著研究的深入，上述作用途徑得以在基因?qū)用婕右越忉尅１驹囼?yàn)通過基線資料調(diào)研問卷和血樣檢測(cè)，獲得了3 156例試驗(yàn)參與者各項(xiàng)臨床資料和基因信息。通過對(duì)上述資料和信息進(jìn)行分析，得到了FTO rs3751812、IL-6 rs1800796和HSP-60 rs2605039三種SNP對(duì)T2DM患者BCa發(fā)病率和OS的影響，從基因?qū)用嬖敿?xì)地描述了三種SNP對(duì)T2DM患者BCa發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和OS的修飾結(jié)果。
T2DM患者外周血淋巴細(xì)胞FTO基因高表達(dá)，是T2DM的早期預(yù)測(cè)因子之一，兩者之間存在顯著相關(guān)性。除血液外，F(xiàn)TO基因在調(diào)節(jié)能量吸收和消耗的重要區(qū)域-下丘腦中表達(dá)水平最高。FTO基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致FTO mRNA在下丘腦中水平上調(diào)，從而導(dǎo)致攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因患者過量攝食并肥胖，進(jìn)而導(dǎo)致T2DM。相較非風(fēng)險(xiǎn)基因型突變雜合子TT人群，F(xiàn)TO rs3751812風(fēng)險(xiǎn)基因型為野生純合子GG的人群平均體重超出3 kg，T2DM發(fā)病率高出1.7倍。FTO基因表達(dá)可影響調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄并參與炎性反應(yīng)相關(guān)基因調(diào)控的關(guān)鍵因子TNF-α和核因子κB的表達(dá)量，從而導(dǎo)致空腹血糖升高，并最終提高T2DM乃至BCa的發(fā)病率[6]。總之，F(xiàn)TO rs3751812同T2DM和BCa均緊密相關(guān)。
表5 多因素Logistic逐步回歸分析試驗(yàn)組和對(duì)照組基因分型分布對(duì)T2DM患者BCa發(fā)病率的影響Table 5 Multivariate logistic stepwise regression analysis of effect of genotyping on BCa incidence in T2DM patients in experiment and control groups
IL-6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的多效淋巴因子，主要作用包括調(diào)節(jié)B細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、增強(qiáng)CTL、NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和刺激造血干細(xì)胞的增生分化等。T2DM患者體內(nèi)IL-6水平顯著上調(diào)，這是由于糖基化終產(chǎn)物刺激細(xì)胞表達(dá)和釋放TNF-α增多，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-6過表達(dá)。而且T2DM患者存在的肥胖、脂代謝紊亂，均屬于慢性炎性反應(yīng)，從而使得脂肪組織具備更活躍的內(nèi)分泌功能，分泌更多的IL-6[7]。相較非風(fēng)險(xiǎn)基因型突變雜合子CG或GG，IL-6 rs1800796風(fēng)險(xiǎn)基因型為野生純合子CC的人群血清IL-6水平顯著升高[8]。因此，在T2DM和風(fēng)險(xiǎn)基因型的雙重作用下，高水平的IL-6可刺激脂肪組織中的芳香酶過表達(dá)，從而刺激雌激素合成并促進(jìn)BCa進(jìn)展；
還可同BCa細(xì)胞中相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子活化，繼而上調(diào)多種蛋白（例如組織蛋白酶B）的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性，介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移[9]。
HSP-60是線粒體中主要的ATP依賴分子伴侶，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞表面。HSP-60在維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用。過表達(dá)的促癌基因HSP-60能夠通過抑制抑癌基因p53和caspase依賴的細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，并通過與其他細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用激活核因子κB途徑而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。T2DM患者處于慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)，從而使得脂肪組織具備更活躍的內(nèi)分泌功能，分泌更多的抵抗素、IL-6和TNF-α等多種細(xì)胞因子和激素，從而引起更強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)HSP-60的表達(dá)。另外，胰島素抵抗為T2DM的重要病理生理學(xué)特征，也屬于慢性炎性反應(yīng)過程，也可促進(jìn) HSP-60表達(dá)[10-12]。相較非風(fēng)險(xiǎn)基因型突變雜合子GT或TT，HSP-60 rs260503**險(xiǎn)基因型為野生純合子GG的人群血清HSP-60水平顯著升高[13]。因此，在T2DM和風(fēng)險(xiǎn)基因型的雙重作用下，高水平的HSP-60通過防止異常蛋白積聚而產(chǎn)生異常折疊，維持細(xì)胞的自穩(wěn)態(tài)而增強(qiáng)了BCa腫瘤細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡。
綜上所述，F(xiàn)TO rs3751812、IL-6 rs1800796和HSP-60 rs2605039對(duì)T2DM患者BCa的影響較為復(fù)雜，其間存在廣泛的共同作用。本試驗(yàn)尚存在一些不足，包括未根據(jù)試驗(yàn)參與者基線資料進(jìn)行分層分析，未進(jìn)一步量化T2DM同IL-6 rs1800796各自對(duì)BCa影響貢獻(xiàn)大小，以及T2DM同HSP-60 rs2605039各自對(duì)BCa的影響程度等，今后我們將對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步研究。
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