劉 潮 ,羅艷萍 ,谷嬉嬉 ,陳健明 ,藍 艷 ,韋葉生
(1.桂林醫學院附屬醫院檢驗科,廣西桂林 541000;2.右江民族醫學院附屬醫院皮膚科,廣西百色 533000)
miRNA 是一類長度為20～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA,通過與靶m RNA 的3"-UTR區特異性結合,從而降解靶m RNA 或者抑制其表達。miRNA 還參與調控細胞增殖、分化與凋亡等多種生物學過程,在機體正常發育、新陳代謝及疾病發生發展等過程中發揮著重要作用[1-2]。miR-208基因作為目前臨床心腦血管疾病研究廣泛的miRNA 之一,其主要機制包括miR-208a可以通過與靶基因活化蛋白C、細胞程序性死亡蛋白結合,加重心肌細胞凋亡、氧化損傷和自噬[3],降低miR-208b-3p表達能夠減輕缺血再灌注損傷心肌細胞氧化應激損傷、炎癥反應,從而抑制心肌細胞凋亡、自噬[4];除了參與體內眾多復雜過程的調控外,miR-208基因還被證明在短暫性腦缺血發作、心肌梗死[5]和冠心病[6]等多種心腦血管疾病中異常表達,并通過調控機制使這些疾病朝著不同的方向改變。血脂異常是上述多種心腦血管疾病的獨立危險因素,早期發現和血脂控制是避免心腦血管疾病發生的重要手段。已有多位學者對不同人群血脂水平與相關基因的單核苷酸多態性(SNP)進行研究,而關于miR-208 基因rs8022522 和rs12894524位點單核苷酸多態性的研究在國內外尚未查閱到有關的文獻報道。因此,本研究對廣西健康人群miR-208基因rs8022522和rs12894524位點采用高通量SNPscan技術進行基因分型檢測,以探究其在不同種族健康人群中的分布特征,并進一步分析兩位點基因多態性與血脂指標的相關性,為今后對miR-208基因在相關疾病進程中的機制研究提供新思路,為群體遺傳學在地區的研究提供參考資料,豐富廣西人群基因數據庫。
1.1 研究對象
隨機選取2020年6月至2021年6月來桂林醫學院附屬醫院體檢的無親緣關系的體檢人群297例,其中女性127例,男性170例,年齡21～79歲,排除患有重大疾病如血液性疾病、腫瘤感染、心腦血管疾病及癌癥等。本研究通過本院倫理委員會審批。
1.2 位點選擇依據
①通過NCBI網站查找miR-208a/b基因多態性情況,盡量選取標簽SNP(tagSNP);②已經被1000基因組計劃(1000 Genomes Project)掃描過的位點;③亞洲人群中次要等位基因頻率大于5%的位點,即MAF＞0.05;經過篩選,最終miR-208a基因rs8022522、miR-208b基因rs12894524被用于進一步研究。
1.3 臨床樣本的采集及處理
抽取研究對象晨起靜脈血3 mL于EDTA-K2抗凝采血管中,用于全血基因組DNA 提取;另外,采集入組研究對象晨起空腹靜脈血4 mL于生化管中,用于血脂生化指標的檢測。放入-80℃冰箱保存備用。
1.4 基因組DNA提取
采用EDTA-K2 抗凝管收集各體檢者靜脈血3.0 mL,血液基因組DNA 提取試劑盒(吸附柱法)購自北京天根生化科技有限公司,并按照其說明書方法提取基因組DNA,將提取的DNA 放置-80℃冰箱分裝儲存。選取DNA 樣本濃度在20～50 ng/μL 范圍之間、OD260/280值在1.7～2.0范圍之間的合格樣本用于后續基因分型實驗。
1.5 引物的設計與合成
登 錄NCBI 查 詢miR-208 基 因rs8022522 和rs12894524 的DNA 序列,引物序列的設計采用Premier 3.0在線軟件進行設計,將設計好的引物序列交給上海天昊公司公司合成。引物序列如下。
rs8022522:上游AGCTCATGCACATTCTTTCCTC,下游GCACCGGCTACAGAATGAGATA
rs12894524:上游CCTGTCATGGTTTACTGTTTGCTG,下游GAAGGAGGAGAGAAAATGAACTAGG。
1.6 連接和多重熒光PCR反應及基因分型檢測
①連接反應:反應體系總體積均為20.0μL,其中包括2.0μL 1×GC 緩沖液I、2.5 mmol Mg2+、0.2 mmol d NTP、0.2μL 引 物、1.0 U HotStarTaq聚合酶和1μL模板DNA,剩余體積用滅菌雙蒸水補足。連接反應參數如下,94℃1 min,58℃4 h,循環4次,94℃2 min,72℃forever。②多重熒光PCR擴增:反應體系總體積20μL,其中包括上述連接產物1.0μL,2×PCR 緩沖液A 10.0μL,TaqDNA 聚合酶0.4μL,多重熒光擴增引物0.5μL,滅菌雙蒸水8.1μL。多重熒光PCR 反應參數如下,96℃1 min,94℃20 s,60℃40 s(每個循環降低0.5℃),72℃2 min,循環9次;94℃20 s,57℃40 s,72℃1.5 min,循環25次;68℃60 min;4℃forever。③基因分型:將上述得到的產物經dd H2O稀釋10倍并振蕩混勻后,取1.0μL該混合液與0.5μL Liz500SIZESTANDARD,8.5μL Hi-Di混勻,95℃變性5 min后在ABI3730XL測序儀上檢測,Polyphred軟件分析原始數據。
1.7 血脂相關指標檢測
采集各受試者空腹12 h靜脈血4 mL,以3 000 r/min離心10 min,分離血清,用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)。
1.8 統計學分析
將所得到的實驗結果用SPSS 20.0軟件進行統計分析。其中,采用直接計數法統計兩位點的基因型和等位基因頻率的分布,之后用SPSS 20.0軟件對兩位點的基因型和等位基因頻率的分布用χ2檢驗來分析,對符合正態分布的血脂等計量資料采用t檢驗,均值±標準差()表示,P＜0.05為差異有統計學意義。
2.1 miR-208基因rs8022522和rs12894524研究對象的一般臨床資料
參與研究的對象一共297名。臨床資料見表1。
表1 研究對象臨床資料Tab.1 Clinical data of the research subjects
2.2 miR-208基因rs8022522和rs12894524兩位點基因分型檢測結果
分型結果顯示,rs8022522存在AA(2.7%)、AG(24.2%)及GG(73.1%)3種基因型,等位基因A、G頻率分別為14.8%、85.2%。rs12894524 位點存在TT(1.3%)、TG(13.5%)以及GG(85.2%)3種基因型,等位基因T、G 頻率為8.1%、91.9%。基因分型結果見圖1、圖2。
圖1 miR-208基因rs8022522位點測序圖Fig.1 The sequencing map of miR-208 gene rs8022522
圖2 miR-208基因rs 12894524位點測序圖Fig.2 The sequencing map of miR-208 gene rs12894524
2.3 廣西健康人群miR-208 基因rs8022522 和rs12894524位點多態性的分布情況
在廣西健康人群miR-208 基因rs8022522 和rs12894524位點中,常見的基因型分別為GG(73.1%)和GG(85.2%),其次為AG(24.2%)和GT(13.5%);其中,頻率最高的等位基因分別為G(85.2%)和G(91.9%)。通過比較兩位點的基因型和等位基因頻率在男女性別間的分布發現差異無統計學意義(P＞0.05,表2)。
表2 廣西健康人群miRNA-208基因rs8022522和rs12894524基因型和等位基因頻率分布Tab.2 Distribution of genotype and allele frequencies of miRNA-208 gene between rs8022522 and rs12894524 in Guangxi population
2.4 廣西健康人群miR-208基因rs8022522和rs12894524兩位點多態性與不同種族人群間的比較
將廣西健康人群rs8022522、rs12894524兩位點基因型和等位基因頻率與Hap Map公布的Hap Map-CEU、Hap Map-YRI及Hap Map-TSI基因多態性數據進行比較(Hap Map 群體數據來自以下網站:http://asia.ensembl.org/index.html),結果顯示三者差異均有統計學意義(P＜0.05);而將結果與Hap-Map-JPT、Hap Map-CHB 相 比,rs8022522、rs12894524基因型和等位基因頻率兩者差異均無統計學意義(P＞0.05,表3,表4)。
表3 廣西健康人群miR-208基因rs8022522基因型和等位基因頻率與不同人群的比較Tab.3 Comparison of genotype and allele frequencies of miR-208 gene rs8022522 polymorphism in Guangxi population and other regional groups
表4 廣西健康人群miR-208基因rs12894524基因型和等位基因頻率與不同人群的比較Tab.4 Comparison of genotype and allele frequencies of miR-208 gene rs12894524 polymorphism in Guangxi population and other regional groups
2.5 miR-208基因rs8022522和rs12894524兩位點不同基因型血脂水平比較
廣西人群rs12894524位點TT、TG、GG基因型攜帶者之間各血脂指標差異均無統計學意義(P＞0.05);rs8022522位點AA、AG、GG基因型攜帶者之間,TG、TC和LDL-C比較,差異沒有統計學意義(P＞0.05);GG組與AG組HDL-C比較,差異有統計學意義(P＜0.05),GG 組HDL-C水平較AG 組高(表5,表6)。
表5 廣西人群miR-208基因rs8022522位點不同基因型血脂水平比較Tab.5 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs8022522 in miRNA-208 gene (mmol/L,)
表5 廣西人群miR-208基因rs8022522位點不同基因型血脂水平比較Tab.5 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs8022522 in miRNA-208 gene (mmol/L,)
與GG 比較,*P＜0.05。
表6 廣西人群miR-208基因rs12894524位點不同基因型血脂水平比較Tab.6 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs12894524 in miRNA-208 gene (mmol/L,)
表6 廣西人群miR-208基因rs12894524位點不同基因型血脂水平比較Tab.6 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs12894524 in miRNA-208 gene (mmol/L,)
miR-208基因作為臨床研究廣泛的miRNA 之一,位于人類第14號染色體上。本研究將miR-208基因兩位點多態性與Hap Map公布的5個人群基因多態性數據比較發現,兩位點的基因型和等位基因頻率同Hap Map-CEU、Hap Map-YRI及Hap Map-TSI相比有統計學差異,與Hap Map-CHB相比無統計學差異。可能是因為廣西人群與Hap Map-CHB 和Hap Map-JPT 人群所處地區同屬于亞洲地區,與Hap Map-CEU 等相比地緣關系相對較近,因此,兩位點的遺傳多態性分布差異相對較小,與遺傳學定律中所描述的“親緣關系越近,其基因型的分布越相似,反之則差異越顯著[7]”相符。而Hap Map-CEU、Hap-Map-YIR 和Hap Map-TSI 3 種人群大多數為白種人、黑種人,廣西人群為黃種人,其地緣關系、親緣關系都相對較遠,多種影響因素阻礙了種族間遺傳物質的交流,久而久之,出現了各群體發生的遺傳變異朝著不同的方向發展的現象,這可能是導致遺傳多態性在上述5種人群中呈現出不同程度差異的原因之一。基因多態性受多種因素的影響,常見的影響因素包括地理位置、種族、生活環境、飲食習慣的不同及遺傳突變等。同一SNP位點與同一疾病的遺傳易感性在不同的地域、人群間也存在不同程度的差異[14],而同一SNP位點基因多態性的差異也能引起不同的疾病。例如,FRAGOSO 等[8]研究發現,miRNA-196a2 C/T(rs11614913)多態性的T 等位基因與冠狀動脈疾病的風險相關,然而LI等[9]研究發現,rs11614913 基因多態性與胃癌風險升高之間有關聯。本次研究結果表明,由于不同種族的遺傳背景、生活方式等不同,同一SNP位點在不同種族間存在不同程度的差異。
隨著人類基因組計劃不斷完善,越來越多的研究發現微小RNA 與腫瘤[10-11]、癌癥[12-13]等多種疾病的發生發展相關。而miR-208基因在多種疾病的發生發展過程中有重要作用,例如,miR-208b-5p在非小細胞肺癌(NSCLC)中下調,miR-208b-5p 可能通過靶向IL-9/STAT3通路阻止上皮-間質轉化(EMT)的激活,降低NSCLC細胞的遷移和侵襲能力[14]。因此,-208b-5p可能代表了一個通過靶向IL-9/STAT3通路來診治非小細胞肺癌的新靶點。miR-208基因在包括動脈粥樣硬化和心肌梗死在內的冠狀動脈疾病中表達升高。血脂水平異常與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關[15],因此,積極控制、干預血脂水平對于以動脈粥樣硬化為病理基礎的疾病防治有著重大的意義。體內脂質代謝受環境、遺傳以及遺傳-環境等多種因素相互作用的影響,而且這種遺傳變異通常存在種族特異性。人類可遺傳變異中最常見是SNPs,是指在基因組的水平上由于單個核苷酸突變引起的DNA 序列多態性[16]。例如,PAN 等[17]研究發現,北京漢族人群血清TC在不同基因型之間存在差異。本研究發現,廣西人群rs8022522位點AG 基因型的HDL-C 水平較GG 基因型HDL-C 水平低,提示rs8022522位點基因多態性與血清HDL-C水平存在相關性。
綜上所述,miR-208基因rs8022522和rs12894524兩位點在中國廣西人群中存在基因多態性,其多態性與不同種族之間比較存在不同程度的差異,不僅為解釋miR-208基因與其相關疾病的發生在不同種族間表現的差異提供一個新的方向,而且還豐富了人類群體遺傳學資料,為進一步相關疾病防治的研究提供了參考資料。
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