朱秀清，鄧筱琪，朱 穎, ，王喜泉，李玉玲，夏曉雨,4
（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150076；
2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；
3.哈爾濱中央紅集團(tuán)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150010；
4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，黑龍江哈爾濱 150086）
大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）具有優(yōu)質(zhì)、廉價(jià)的特點(diǎn)且功能特性廣泛，在許多行業(yè)被廣泛使用[1]。大豆粉碎后經(jīng)低溫脫脂、堿溶酸沉工藝后提取即可得到SPI，SPI中大豆蛋白含量達(dá)到88%以上[2]。大豆分離蛋白具有許多功能特性，如凝膠性[3?6]、乳化性[7?8]、持水性[9]、持油性[10]以及溶解性等。SPI的功能特性與其中7S（β-conglycinin）和11S（glycinin）組分密切相關(guān)。因此，探究蛋白質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系是研究與開發(fā)大豆分離蛋白產(chǎn)品的基礎(chǔ)。
近些年來(lái)，大豆蛋白制品越來(lái)越豐富，應(yīng)用十分廣泛，其中蛋白凝膠制品受關(guān)注度最高。蛋白凝膠是指大豆蛋白經(jīng)變性后與相鄰的蛋白分子之間通過(guò)化學(xué)作用力形成的一類三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，也可與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、硫酸鈣（CaSO4）等相互作用形成蛋白凝膠制品。蛋白凝膠作為包埋不穩(wěn)定小分子活性物質(zhì)（維生素、益生菌等）的載體，其凝膠特性也是蛋白質(zhì)最重要的功能特性[11]。影響大豆蛋白凝膠形成的因素可分為兩大類：內(nèi)在因素和外在因素。其中內(nèi)在因素主要是大豆蛋白的組成（7S蛋白、11S蛋白以及兩種蛋白存在的濃度和比例、鹽離子濃度以及多糖、脂質(zhì)與蛋白之間的相互作用等）；
而外部環(huán)境因素則是物理、化學(xué)及生物等前處理方式引起大豆蛋白改性導(dǎo)致的凝膠性改變（如熱處理、超聲波處理、高壓處理、擠壓處理、菌誘導(dǎo)和酶水解等）[12?13]。研究表明：在不同因素影響下大豆蛋白產(chǎn)生凝膠，天然大豆蛋白聚集體的穩(wěn)定性較差，其結(jié)構(gòu)在持續(xù)發(fā)生解離，變性蛋白聚集體的穩(wěn)定時(shí)間一般為一周左右，這表明蛋白質(zhì)在變性時(shí)形成了更加持久穩(wěn)定的化學(xué)鍵以維持聚集體，從而提高蛋白凝膠制品的穩(wěn)定性[2]。
凝膠的形成是多種因素共同作用的結(jié)果，各因素的變化會(huì)導(dǎo)致形成具有不同性質(zhì)差異的凝膠。本文主要通過(guò)綜述前人對(duì)蛋白質(zhì)凝膠形成機(jī)理及穩(wěn)定性的研究，對(duì)大豆蛋白構(gòu)象及組成、多糖、脂質(zhì)間的相互作用等內(nèi)在影響因素，以及物理、化學(xué)、生物等前處理加工方式進(jìn)行深入探討及解析。
蛋白質(zhì)凝膠的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包含蛋白質(zhì)變性、解離、聚集和凝膠化等多個(gè)物理化學(xué)反應(yīng)，目前普遍認(rèn)為加熱是蛋白質(zhì)膠凝過(guò)程中必不可少的步驟[14]。蛋白質(zhì)分子受熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，使蛋白質(zhì)分子從天然的折疊狀態(tài)舒展開，內(nèi)部隱藏的活動(dòng)位點(diǎn)以及功能性基團(tuán)暴露（包括巰基或疏水基團(tuán)），然后通過(guò)疏水、靜電及氫鍵、巰基二硫鍵等交換反應(yīng)進(jìn)行相互作用，使分子間進(jìn)行交聯(lián)，形成可逆的蛋白質(zhì)聚集體，導(dǎo)致粒徑增大。當(dāng)聚集體的濃度足夠時(shí)，分子間發(fā)生進(jìn)一步的聚集，形成三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，即蛋白凝膠形成[15?17]。而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度較低時(shí)，聚集可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。除熱處理外，還有加酸、加酶、加鹽以及離子誘導(dǎo)等方式均可形成蛋白質(zhì)凝膠[18?21]，其中加酸通過(guò)改變體系pH，影響蛋白所帶凈電荷數(shù)，從而改變蛋白存在的點(diǎn)和環(huán)境，影響凝膠的形成；
加鹽或離子誘導(dǎo)則是通過(guò)改變蛋白與蛋白間或蛋白與環(huán)境間的靜電斥力，影響蛋白分子量的分布和蛋白粒徑的大小，從而影響凝膠的形成，大豆蛋白冷凝膠通常就是通過(guò)添加鹽、植酸等凝固劑形成的，見圖1。
圖1 大豆蛋白熱、冷凝膠形成機(jī)理Fig.1 Soy protein hot and cold gel formation mechanism
李云[22]通過(guò)加熱、加酸及加酶三種不同的處理方式，制備了5種具有不同功能特性的大豆蛋白聚集體，將其與天然大豆蛋白混合后制成熱凝膠，結(jié)果表明添加少量的蛋白聚集體可提高大豆蛋白的凝膠性質(zhì)，但過(guò)量的蛋白聚集體則會(huì)使大豆蛋白的凝膠性降低。Yang等[23]發(fā)現(xiàn)，低pH處理能夠明顯提高SPI的疏水性和糖基化能力，增強(qiáng)凝膠粒子在溶液中的穩(wěn)定性。因此，蛋白聚集對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響主要是在微觀形態(tài)上對(duì)相分離程度和膠凝速度產(chǎn)生影響。
按照溶解特性，可將大豆蛋白分為球蛋白與清蛋白，其中球蛋白大約占總蛋白質(zhì)含量的90%。根據(jù)蛋白質(zhì)在緩沖液（pH7.6，0.5 mol/L）中的沉降系數(shù)不同，又可將大豆球蛋白分為四個(gè)組分，分別是：2S（15%）、7S（34%）、11S（41.9%）和 15S（9.1%）[24]。2S 組分包含：Bowman-Birk 和 Kunitz 型胰蛋白酶抑制劑、細(xì)胞色素C等[15]。7S組分主要是β-伴大豆球蛋白，但也包含γ-伴大豆球蛋白、脂肪氧合酶、α-淀粉酶和凝集素[25]。11S蛋白和15S蛋白分別是大豆球蛋白和它的聚合體。研究表明，不同比例的7S蛋白與11S蛋白會(huì)影響大豆蛋白質(zhì)的凝膠性，通過(guò)調(diào)節(jié)二者比例可以形成具有不同凝膠特性的大豆蛋白凝膠[26]。因此，亞基組成比例對(duì)大豆蛋白功能性的影響一直是相關(guān)學(xué)者研究的重點(diǎn)。
2.1 7S蛋白組成對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
7S球蛋白是一種三聚體共軛型的糖蛋白（150～200 kDa），由α亞基（72 kDa）、α′亞基（76 kDa）和β亞基（53 kDa）三種亞基組成，該三種亞基通過(guò)氫鍵及疏水相互作用力隨機(jī)排列組合在一起，形成平面三角形緊密堆積成7S蛋白分子[27?29]，并形成七種不同的存在形式：βββ、ββα′、ββα、βαα′、βαα、ααα′和ααα[30?32]。不同亞基組成導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠化效果不同，同時(shí)亞基間的相互作用也會(huì)影響蛋白質(zhì)凝膠的穩(wěn)定性。
7S球蛋白的α′亞基（76 kDa）與α亞基（72 kDa）分子質(zhì)量極其相似，通常作為一個(gè)對(duì)象進(jìn)行研究。在研究α′與α亞基對(duì)大豆蛋白的凝膠特性的影響中，該兩種亞基均表現(xiàn)出了與凝膠特性的顯著相關(guān)性。袁德保等[31]探討了大豆蛋白α、α′、β與堿性亞基各亞基間的熱聚集凝膠化行為機(jī)制，結(jié)果指出α、α′和β亞基對(duì)蛋白的熱聚集反應(yīng)均起到抑制作用，其中α、α′亞基抑制效果強(qiáng)于β亞基。Mohamad等[33]對(duì)比完整7S蛋白與缺失α′亞基的7S蛋白制備的內(nèi)脂豆腐凝膠，缺少α′亞基的豆腐凝膠硬度較高，故推斷7S蛋白α′亞基對(duì)內(nèi)脂豆腐硬度和凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生了明顯的負(fù)作用。
2.2 11S蛋白組成對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
11S球蛋白是一種六聚體型的非糖蛋白（300～380 kDa），由酸性亞基A（35～37 kDa）和堿性亞基B（20 kDa）通過(guò)二硫鍵作用組成11S球蛋白單體[34?35]。Utsumi等[36]根據(jù)11S球蛋白酸性亞基和堿性亞基的N-端氨基酸序列將11S球蛋白亞基區(qū)分為以下五個(gè)主要的亞基：A1aB1b、A1bB2、A2B1a、A3B4和A5A4B3。
11S蛋白凝膠形成是11S蛋白亞基相互作用的結(jié)果。Nakamura等[37]揭示了11S蛋白凝膠形成的機(jī)理（圖2）：在短時(shí)加熱過(guò)程中（約15 s），蛋白質(zhì)分子形成包含6個(gè)11S蛋白亞基的線狀聚集體Ⅰ（鏈Ⅰ），此時(shí)線狀聚集體Ⅰ中的蛋白亞基仍是球狀；
接著線狀聚集體Ⅰ發(fā)生自身聚集，形成長(zhǎng)度較長(zhǎng)的直鏈聚集體Ⅱ（鏈Ⅱ），直鏈聚集體Ⅱ進(jìn)一步與自身發(fā)生聚集形成長(zhǎng)度更長(zhǎng)的直鏈型聚集體或與線狀聚集體Ⅰ形成支鏈型聚集體，統(tǒng)稱聚集體Ⅲ（鏈Ⅲ），該聚集體Ⅲ即為構(gòu)成11S蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基本單位。
圖2 11S大豆球蛋白凝膠化形成聚合物過(guò)程Fig.2 11S soybean globulin gel forming polymer process
James等[38]通過(guò)選取11S球蛋白完整以及缺失11SA4亞基的大豆來(lái)制備豆腐，結(jié)果表明11SA4亞基缺失對(duì)豆腐凝膠組織結(jié)構(gòu)及硬度具有積極影響，因此缺失該亞基可以提高豆腐的凝膠硬度以及保水能力。Yang等[39]探討不同蛋白含量大豆蛋白11SA4亞基的缺失與其中7S和11S蛋白水平的相關(guān)性關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，11SA4亞基的缺失與大豆蛋白凝膠的保水力呈正相關(guān)。在蛋白質(zhì)含量較高時(shí)選擇性去除11SA4亞基可以提高凝膠組織硬度和保水能力。這和James的研究結(jié)果相似。Bainy等[40]在對(duì)蛋白質(zhì)亞基組成與大豆分離蛋白的凝膠特性的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)：11S球蛋白的A3亞基的存在阻礙了凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。Tezuka等[41]的研究證實(shí)，大豆中11S蛋白A1和A2亞基含量較多更易發(fā)生聚集。綜上所述，11S蛋白的亞基組成對(duì)蛋白凝膠的性質(zhì)有顯著影響。
2.3 7S和11S蛋白比例對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
7S伴大豆球蛋白主要影響蛋白凝膠的黏性和彈性，11S大豆球蛋白影響的則是蛋白凝膠的硬度和咀嚼性。兩種蛋白的影響效果并不是獨(dú)立的，在Yang等[39]的研究中發(fā)現(xiàn)11SA4亞基的缺失會(huì)引起7S蛋白的代償性積累。因此，應(yīng)綜合分析7S和11S蛋白對(duì)凝膠性的影響。截止目前，可以確定兩種蛋白的占比不同形成的凝膠性質(zhì)有顯著差異。Ji等[42]發(fā)現(xiàn)11S蛋白占比較高時(shí)形成的豆腐凝膠具有較強(qiáng)的硬度和內(nèi)聚力。Nakamura等[37]的研究得出了相似的結(jié)論：在相同的條件下對(duì)比11S和7S蛋白形成的凝膠，發(fā)現(xiàn)11S蛋白凝膠的強(qiáng)度要強(qiáng)于7S蛋白凝膠。為探討兩種蛋白形成凝膠的差異來(lái)源，單獨(dú)加熱兩種組分，7S蛋白不會(huì)生成凝膠或只形成透明且較為柔軟的凝膠，11S蛋白則形成硬度和黏彈性較高的凝膠。通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生這種差異的原因是11S蛋白在形成凝膠的過(guò)程中形成了較多的二硫鍵[43]。
隨著研究的不斷深入，更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在加熱過(guò)程中7S蛋白和11S蛋白的變性溫度不同，7S蛋白的變性溫度高于11S蛋白[44]。加熱凝膠化過(guò)程中向11S蛋白中加入分離的7S蛋白可防止11S蛋白及其亞基的熱聚集，而當(dāng)兩種蛋白共同加熱凝膠化時(shí)，11S的B亞基和7S的β亞基通過(guò)靜電力優(yōu)先締合[45?46]。He等[47]證實(shí)了這個(gè)結(jié)論，當(dāng)加熱溫度高于11S蛋白的變性溫度后，11S蛋白的AB亞基均會(huì)發(fā)生不同程度的變性解離，解離后的肽鏈B會(huì)通過(guò)靜電相互作用與7S的β亞基形成可溶性的復(fù)合物B-β，或與自身通過(guò)疏水相互作用形成致密且體積更大的聚集體，而酸性亞基A與α、α′亞基則通過(guò)二硫鍵相互作用形成寡聚體或單體（圖3）。這種聚集體B-β被認(rèn)為是大豆蛋白凝膠強(qiáng)度較大的直接原因。王洪晶[25]的研究證實(shí)了這個(gè)結(jié)論，他發(fā)現(xiàn)可溶性的蛋白聚集體會(huì)增強(qiáng)蛋白凝膠的物化性質(zhì)，而不溶性的蛋白聚集體則會(huì)破壞蛋白凝膠的物化性質(zhì)。在凝膠過(guò)程中，蛋白亞基間的共價(jià)作用使不溶性的蛋白聚集體無(wú)法解離或充分伸展，因而阻礙凝膠的形成。
圖3 7S與11S蛋白熱處理過(guò)程中的相互作用Fig.3 7S and 11S proteins interaction in the process of heat treatment
綜上所述，11S、7S兩種蛋白組分均會(huì)對(duì)蛋白凝膠產(chǎn)生影響。當(dāng)只有11S蛋白存在時(shí)，形成了含有較多二硫鍵的蛋白凝膠，故其凝膠硬度明顯強(qiáng)于只有7S蛋白存在時(shí)形成的凝膠。當(dāng)兩種組分同時(shí)存在時(shí)，11S蛋白堿性亞基B與7S蛋白β亞基形成可溶性聚合物，這種聚合物以沉淀的形式聚集，而A亞基與α亞基形成的單體或寡聚體以不溶性聚合物的形式聚集在上清液中，故認(rèn)為B-β聚合物會(huì)對(duì)蛋白凝膠硬度產(chǎn)生直接影響。隨著體系中11S蛋白組分含量的提高或7S蛋白組分含量的降低，蛋白質(zhì)凝膠的物化性質(zhì)隨之提高。因此選擇具有特定蛋白組分的專有大豆品種進(jìn)行大豆蛋白的加工研究可能是日后大豆蛋白加工研究的新基礎(chǔ)。
3.1 蛋白濃度對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
蛋白質(zhì)在不同濃度具有不同的熱穩(wěn)定性，這種性質(zhì)是蛋白濃度對(duì)凝膠產(chǎn)生影響的重要原因之一。Yang等[39]的研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白含量與蛋白凝膠質(zhì)地的硬度間具有正相關(guān)效應(yīng)。Elise等[48]的研究得到類似的結(jié)論，在豆?jié){酸化形成凝膠過(guò)程中，蛋白質(zhì)濃度不會(huì)對(duì)凝膠形成的pH產(chǎn)生影響，但會(huì)顯著影響凝膠硬度，蛋白濃度為7%的豆?jié){形成凝膠其硬度顯著強(qiáng)于4%形成的凝膠。這是因?yàn)殡S蛋白質(zhì)濃度的增加，蛋白質(zhì)分子之間的距離縮短，蛋白質(zhì)分子間碰撞機(jī)會(huì)增多，因而更容易發(fā)生聚集，形成更加密集的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
Tian等[49]研究在相同條件下（pH7，0 mmol/L NaCl），7S蛋白的溶液濃度從0.5 mg/mL 增大到10 mg/mL，7S蛋白的凈電荷顯著增加，蛋白間的靜電斥力增大，促進(jìn)7S蛋白結(jié)構(gòu)的展開和重排。其次，在蛋白質(zhì)濃度較高的條件下，蛋白質(zhì)熱聚集體的相對(duì)分子質(zhì)量更大，并且凝膠開始形成的溫度降低。Su等[3]在對(duì)大豆分離蛋白-蛋清復(fù)合凝膠進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合凝膠的硬度、彈性和持水性會(huì)隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而增加。綜上，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾樱纬傻哪z具有更好的彈性和持水性，這對(duì)凝膠的性能具有積極的影響。
3.2 鹽離子濃度對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
蛋白質(zhì)溶液中加入一定濃度鹽離子后，會(huì)影響體系的pH和凝膠形成時(shí)間[50]。7S和11S蛋白的變性溫度隨著鹽濃度增加逐漸升高，影響蛋白質(zhì)凝膠的形成。隨著鹽離子濃度增加，7S蛋白形成凝膠的時(shí)間延長(zhǎng)，得率降低，但凝膠的穩(wěn)定性增加[51]。
鹽離子可促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的聚集。王逢秋節(jié)等[52]發(fā)現(xiàn)添加MgCl2顯著地改變了豆腐凝膠的整體特性，形成質(zhì)地均勻且致密地豆腐凝膠。Chen等[53]的研究發(fā)現(xiàn)體系中加入低濃度的鹽離子可以屏蔽蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，內(nèi)部的酸、堿性亞基暴露，蛋白質(zhì)間的相互作用增強(qiáng)而發(fā)生聚集。Tang等[19]的研究得出了類似結(jié)論，在pH2.0，溫度為80 ℃的條件下對(duì)大豆7S蛋白體系添加NaCl，隨著NaCl濃度的增加，大豆7S蛋白的纖維數(shù)量、長(zhǎng)度增加，對(duì)形成凝膠有積極作用。Geng等[54]證實(shí)了以上結(jié)論，通過(guò)添加鹽離子（磷酸鹽）改變蛋白體系內(nèi)的離子強(qiáng)度，離子強(qiáng)度的改變引起離子的靜電屏蔽效應(yīng)，改變蛋白聚集體間排斥力，有利于蛋白解離后的重聚集，促進(jìn)凝膠的形成。
鹽離子濃度與大豆蛋白凝膠地形成密切相關(guān)，形成的凝膠其凝膠微觀結(jié)構(gòu)以及凝膠強(qiáng)度等凝膠特性都與鹽離子濃度呈高度依賴性。鹽誘導(dǎo)形成的大豆冷凝膠制品如MgCl2鹵水豆腐等已被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。
3.3 其他內(nèi)在因素對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
除上述因素外，大豆組成體系中還存在脂質(zhì)、多糖等物質(zhì)，也會(huì)對(duì)蛋白凝膠產(chǎn)生不同程度的影響。脂質(zhì)作為蛋白凝膠的顆粒填充物，對(duì)凝膠的質(zhì)構(gòu)等特性也起著重要作用。不同脂肪濃度和含量的差異，對(duì)蛋白凝膠有顯著影響。
研究表明脂質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)聚集體之間進(jìn)行相互作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)凝結(jié)，增強(qiáng)蛋白凝膠的硬度，使其具有更緊密的蛋白網(wǎng)絡(luò)[55]。Dian等[56]通過(guò)向SPI中添加不同類型和濃度的脂肪制成凝膠，添加的脂肪作為填充物改善了凝膠的硬度和性能，添加無(wú)水乳脂的SPI其凝膠性能優(yōu)于添加棕櫚油硬脂和添加大豆油的SPI凝膠，當(dāng)無(wú)水乳脂添加濃度為2%時(shí)最佳。李菊芳[57]將磷脂添加到大豆蛋白粉中制成凝膠，結(jié)果表明磷脂的復(fù)合對(duì)凝膠硬度、內(nèi)聚性、彈性均產(chǎn)生重要影響。這表明脂質(zhì)在一定程度上有助于大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，適量的脂質(zhì)會(huì)改善大豆蛋白的凝膠特性，而脂質(zhì)添加量過(guò)量或不足都會(huì)造成蛋白凝膠性質(zhì)的減弱。
多糖通過(guò)與蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)改變蛋白凝膠化行為。Zhao等[58]向SPI中添加不同種類的多糖后采用硫酸鈣誘導(dǎo)形成凝膠，其中添加了魔芋膠的蛋白凝膠結(jié)構(gòu)最為致密，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)魔芋膠通過(guò)增強(qiáng)氫鍵使蛋白凝膠的斷裂應(yīng)力增強(qiáng)，促進(jìn)膠凝形成，增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度。Wang等[59]研究發(fā)現(xiàn)涼粉草多糖富含羥基和羧基，可以促進(jìn)大豆蛋白進(jìn)一步聚集，使添加了涼粉草多糖的大豆蛋白凝膠具有良好的凝膠特性及流變學(xué)特性。
目前學(xué)術(shù)研究上常用于蛋白加工的前處理方式有熱處理、超聲處理、高壓均質(zhì)處理、擠壓預(yù)處理等物理方式，還有通過(guò)酶改性，以及菌類誘導(dǎo)等生物改性方法。前處理一般通過(guò)改變蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)從而使蛋白變性。
4.1 熱處理對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
大豆蛋白的熱變性被認(rèn)為是形成凝膠的先決條件。熱處理會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白發(fā)生不可逆變性，內(nèi)部隱藏的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)并參與疏水相互作用，蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，肽鏈展開后發(fā)生重折疊形成新的蛋白結(jié)構(gòu)，這是大豆蛋白形成凝膠所必需的。
加熱溫度對(duì)大豆蛋白凝膠的影響主要是基于不同加熱溫度下，大豆蛋白具有不同的變性程度，而蛋白質(zhì)變性是凝膠形成的必要條件。在加熱過(guò)程中，大豆蛋白亞基發(fā)生解離和重排。Lakshmanan[60]與Nik 等[61]均證明大豆蛋白在約60～70 ℃和85～90 ℃表現(xiàn)出兩個(gè)峰值變性溫度，分別對(duì)應(yīng)7S和11S的變性溫度。Nagano等[62]研究溫度對(duì)7S和11S蛋白動(dòng)態(tài)流變性質(zhì)的影響，隨著加熱溫度的升高，蛋白質(zhì)凝膠形成所需的時(shí)間減少，得率增加。Renkema等[63]測(cè)定了76～94 ℃內(nèi)不同溫度下蛋白質(zhì)的變性程度與凝膠彈性模量相關(guān)性，結(jié)果表明在變性溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高，蛋白質(zhì)變性程度增大，凝膠的彈性模量也越大，硬度越強(qiáng)。Wu等[64]將加熱溫度從85 ℃提高到100 ℃，大豆蛋白凝膠的破碎力增加了3倍，形成了結(jié)構(gòu)更堅(jiān)硬的大豆蛋白凝膠。加熱時(shí)間同樣對(duì)大豆蛋白的變性具有重要影響，將加熱時(shí)間從30 min延長(zhǎng)到120 min，凝膠的破碎力增加了三分之一，但繼續(xù)延長(zhǎng)加熱時(shí)間凝膠的破碎力反而下降。Zhang等[18]對(duì)比其他方法變性SPI制備形成的蛋白凝膠，發(fā)現(xiàn)熱濕變性SPI形成的凝膠具有更緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及更高的表面疏水性。這表明熱變性對(duì)SPI的凝膠性是具有正效應(yīng)的，熱處理是一種相對(duì)安全且有效的處理手段。
4.2 超聲預(yù)處理對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
超聲波是一種頻率高于20000 Hz的聲波，近年來(lái)廣泛運(yùn)用于食品的物理加工領(lǐng)域，尤其是蛋白、膳食纖維、多糖及各種食品功能成分的改性與提取中。Hu等[65]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超聲波可通過(guò)破壞非共價(jià)相互作用改變聚集體的粒徑、表面疏水性、自由巰基含量等，改變蛋白質(zhì)間的二硫鍵、疏水作用力等化學(xué)作用力，從而獲得物化性質(zhì)各異的大豆蛋白凝膠。王小英等[66]研究了超聲波對(duì)大豆蛋白組分的改性作用，發(fā)現(xiàn)在蛋白濃度為12.5 mg/mL時(shí)在超聲功率為700 W的條件下處理20 min，大豆蛋白的NSI（nitrogen solubility index，NSI）值提高為原來(lái)的5.9倍。超聲處理后的大分子組分明顯增多，小分子組分降低，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集行為。Zhao等[67]在研究中證實(shí)了蛋白質(zhì)的聚集行為，超聲-熱處理使大豆蛋白的平均粒徑減小，表面疏水性和游離巰基含量均增加，改變了SPI的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，具體表現(xiàn)為SPI中的α-螺旋和β-折疊有序結(jié)構(gòu)增多，微觀結(jié)構(gòu)比未超聲處理的SPI凝膠更加致密，形成了結(jié)構(gòu)均勻、致密的改性蛋白凝膠。
Tian等[68]的研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理不僅可以提高SPI凝膠的生成速度，還增強(qiáng)了凝膠的儲(chǔ)能模量、凝膠強(qiáng)度和持水性。研究中發(fā)現(xiàn)超聲處理會(huì)破壞蛋白體系中的非共價(jià)相互作用，導(dǎo)致肽鍵斷裂，從而引起結(jié)構(gòu)改變，暴露其中的作用位點(diǎn)，達(dá)到促進(jìn)凝膠點(diǎn)快速形成，加速凝膠形成的效果。Huang等[69]的研究發(fā)現(xiàn)超聲通過(guò)空化效應(yīng)產(chǎn)生的剪切力能有效減小蛋白聚集體的尺寸，使較大的蛋白聚集體解離成初級(jí)聚集體，大豆蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Ogemdi等[70]證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)，認(rèn)為較長(zhǎng)時(shí)間的高強(qiáng)度超聲（High Intensity Ultrasound, HIU）處理，其超聲空化效應(yīng)只改變SPI的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)蛋白溶解性和表面疏水性，提高凝膠性能，但并不會(huì)影響蛋白質(zhì)氨基酸的組成，因此超聲后的大豆蛋白被認(rèn)為是更適用于應(yīng)用的食品成分。
但超聲處理也會(huì)對(duì)SPI凝膠產(chǎn)生負(fù)面作用。劉冉等[71]采用不同功率的超聲波對(duì)SPI凝膠進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，低功率的超聲波會(huì)減弱SPI凝膠的形成能力；
高功率的超聲波會(huì)使SPI發(fā)生降解，影響蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，延遲凝膠的形成時(shí)間；
只有中功率（200～600 W）的超聲波處理通過(guò)改變SPI的黏彈結(jié)構(gòu)，使SPI發(fā)生更為有序的交聯(lián)作用，能明顯提高SPI的凝膠性能。
4.3 高壓均質(zhì)預(yù)處理對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
高壓均質(zhì)（High-pressure homogenization，HPH）處理具有高剪切力、高壓力作用，可以改變蛋白質(zhì)原有的剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)。適度改變蛋白間的相互作用力，可改變蛋白的空間構(gòu)象，是一種安全、有效的物理方法。呂博等[72]研究表明，經(jīng)高壓均質(zhì)處理，隨均質(zhì)壓力的上升（0～40 MPa），大豆分離蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，展開的多肽鏈里暴露的官能團(tuán)經(jīng)疏水相互作用聚集形成致密的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其凝膠特性和溶解性均得到了顯著改善。
Wang等[73]發(fā)現(xiàn)，隨著高壓均質(zhì)壓力上升為200 MPa時(shí)，大豆蛋白的游離巰基含量顯著增加，隨著壓力進(jìn)一步上升，游離巰基含量降低，破壞了蛋白質(zhì)分子間的疏水性結(jié)構(gòu)區(qū)域，改變了分子間的作用力平衡，使蛋白大分子熱聚集體轉(zhuǎn)為小分子的聚集體，熱致凝膠的凝膠性能下降。同樣的，Kang等[74]的研究中發(fā)現(xiàn)，高壓均質(zhì)會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白變性，其中它們的解離締合行為會(huì)引起大豆球蛋白中7S/11S組分的變化。Bi等[75]研究了均質(zhì)壓力對(duì)大豆蛋白凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)能夠增加SPI中凝膠形成的活性位點(diǎn)，提高SPI的凝膠形成能力，縮短SPI酸誘導(dǎo)凝膠的形成時(shí)間。
因此可以發(fā)現(xiàn)，高壓均質(zhì)是通過(guò)高剪切、高壓改變蛋白聚集體二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白分子構(gòu)象使蛋白變性，經(jīng)高壓均質(zhì)處理會(huì)縮短SPI形成凝膠的時(shí)間，同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)蛋白凝膠的凝膠特性，使其具有更強(qiáng)的粘彈性、持水性和凝膠強(qiáng)度，形成結(jié)構(gòu)更為致密均勻的凝膠。
4.4 擠壓預(yù)處理對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
除以上物理方法外，擠壓也是常用的大豆蛋白物理改性方法之一，廣泛應(yīng)用于食品加工中。擠壓技術(shù)是通過(guò)在擠壓過(guò)程中熱效應(yīng)產(chǎn)生的高溫、高壓和高剪切力破壞大豆蛋白的天然結(jié)構(gòu)，暴露出分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)，在疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等的共同作用下形成分子量較大的蛋白質(zhì)聚集體。
隨著擠壓加工溫度的升高，蛋白質(zhì)的溶解性變差[76]。Silva等[77]發(fā)現(xiàn)在擠壓過(guò)程中游離巰基和總巰基含量增加，而二硫鍵含量下降。Fang等[78]研究了高濕環(huán)境下大豆蛋白擠壓技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在該環(huán)境下擠壓，由于機(jī)械能的增加，由二硫鍵等化學(xué)鍵鏈接的聚合體解聚會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白分子鏈伸展，蛋白溶解性增加。但Zheng等[79]發(fā)現(xiàn)，雖然高溫、高剪切的環(huán)境能改變蛋白的溶解度及分子量分布，但過(guò)高的螺桿轉(zhuǎn)速和溫度（高于150 ℃）會(huì)破壞已形成的蛋白聚集體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白再次展開。
由于擠壓使蛋白內(nèi)部埋藏的酶切位點(diǎn)暴露，有利于酶進(jìn)行反應(yīng)，因此擠壓技術(shù)也常作為前處理手段與酶法相結(jié)合對(duì)蛋白凝膠進(jìn)行改性。Ma等[80]發(fā)現(xiàn)擠壓-酶解處理能顯著改善大豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。在我們之前的研究中也將擠壓技術(shù)與酶解法相結(jié)合研究大豆分離蛋白的功能性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)擠壓處理后進(jìn)行酶水解，對(duì)大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)具有積極影響[81]。這些結(jié)果表明擠壓技術(shù)可以作為一種有效的蛋白改性手段應(yīng)用于食品工業(yè)中。
4.5 酶法對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
傳統(tǒng)的“堿溶酸沉”法制備SPI通常因?yàn)榧庸み^(guò)程及工藝參數(shù)的差異，導(dǎo)致SPI發(fā)生變性，其凝膠性質(zhì)受到不同程度的破壞，所以通常對(duì)SPI進(jìn)行改性。酶法修飾SPI與其他物理、化學(xué)改性方法相比較，具有高安全性、高專一性及作用方式溫和的特點(diǎn)，是近幾年的研究熱點(diǎn)。酶法修飾大豆蛋白是通過(guò)限制性水解肽鍵，改變蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，使分子量顯著降低，其內(nèi)部的官能團(tuán)暴露量增加，提供更多的反應(yīng)位點(diǎn)，催化凝膠形成的過(guò)程[82]。
4.5.1 TG酶 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，簡(jiǎn)稱TG酶或TGase）是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，其催化作用可以明顯改善凝膠強(qiáng)度、保水能力以及流變性，同時(shí)反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、生成的凝膠產(chǎn)物具有更復(fù)雜穩(wěn)定且不可逆的凝膠結(jié)構(gòu)，有關(guān)學(xué)者關(guān)于TG酶對(duì)SPI凝膠的影響研究也最為廣泛和深入。TG酶影響SPI凝膠性是通過(guò)催化蛋白質(zhì)的多肽發(fā)生分子間或分子內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)作用，形成高分子的聚合物來(lái)改變蛋白質(zhì)的疏水性，從而形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠[83]。TG酶的作用機(jī)理具體可分為氨基導(dǎo)入交聯(lián)、共價(jià)交聯(lián)作用以及脫酰氨基反應(yīng)三類[84?85]，其中氨基導(dǎo)入交聯(lián)是TG酶途徑糖基化的反應(yīng)作用原理；
共價(jià)交聯(lián)作用形成高分子聚合物改變SPI的溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性等性質(zhì)；
脫酰氨基反應(yīng)則是改變蛋白的疏水相互作用從而改變蛋白凝膠性[86]。
Qin等[87]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TG酶作用后，可以誘導(dǎo)分子間二硫鍵的形成，蛋白質(zhì)的無(wú)規(guī)卷曲增多，折疊結(jié)構(gòu)打開，同時(shí)改變了蛋白凝膠的流變性。Zhang等[88]報(bào)告在雞蛋-大豆分離蛋白復(fù)合凝膠中，TG酶的主要作用是使復(fù)合凝膠中的SPI發(fā)生交聯(lián)化，顯著提高復(fù)合凝膠的凝膠硬度。但TG酶對(duì)蛋白凝膠的影響并不全是積極的。Luo等[89]的研究中指出，TG酶前處理顯著影響大豆分離蛋白的凝膠化行為，且高度依賴于凝膠反應(yīng)過(guò)程中TG酶的酶濃度。低濃度（1或3 U/蛋白質(zhì)）的TG酶前處理能增強(qiáng)SPI凝膠硬度，但高濃度（5 U/蛋白質(zhì)）TG酶前處理會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)度交聯(lián)，形成粗糙的凝膠結(jié)構(gòu)，破壞凝膠強(qiáng)度。
綜上，TG酶法是一種高效、綠色的蛋白質(zhì)改性法。添加適量的TG酶可以促使蛋白質(zhì)進(jìn)一步交聯(lián)形成具有更高硬度的凝膠。目前TG酶法改性現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于改善多種食物蛋白凝膠的功能特性和質(zhì)構(gòu)特性中。
4.5.2 其他蛋白酶 除TG酶外，還有其他蛋白酶都對(duì)SPI凝膠有改性作用，如堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。酶改性蛋白的功能特性與蛋白酶種類呈強(qiáng)烈相關(guān)性。在之前的研究中采用堿性蛋白酶對(duì)SPI進(jìn)行酶解，在酶解后SPI水解成小分子肽，形成多肽聚集體，其柔韌性和乳化性得到改善[81]。Tian等[68]選取堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，得到了類似的結(jié)論，這表明堿性蛋白酶與蛋白乳化性相關(guān)程度更高，會(huì)抑制蛋白的凝膠行為。趙新淮等[90]將SPI分別經(jīng)胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解后，對(duì)比發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶處理后的SPI凝膠性得到顯著改善，原因是中性蛋白酶的催化反應(yīng)位點(diǎn)比胰蛋白酶多，水解程度較大，降低了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，故形成的凝膠較弱。余留印[91]的研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶酶解處理SPI可以有效降低蛋白質(zhì)的分子量，適度的酶促水解可使蛋白分子內(nèi)部的非極性氨基酸殘基暴露，增強(qiáng)蛋白分子間的疏水相互作用，改善凝膠結(jié)構(gòu)。
4.6 微生物因素對(duì)大豆蛋白凝膠的影響
近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)過(guò)酸化、蛋白質(zhì)水解、風(fēng)味形成以及代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)過(guò)程，該過(guò)程中能夠形成乳酸，可降低體系的pH，從而促使蛋白質(zhì)變性加快，聚集形成凝膠。Yang等[92]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵誘導(dǎo)SPI形成凝膠能夠顯著提高了大豆蛋白凝膠的硬度和保水能力，且凝膠特性對(duì)發(fā)酵所用的乳酸菌具有依賴性，不同乳酸菌誘導(dǎo)的SPI凝膠具有各自的特殊性。微生物的接種量同樣也會(huì)影響凝膠的性質(zhì)。李良等[93]通過(guò)植物乳桿菌發(fā)酵制備蛋白凝膠，發(fā)現(xiàn)接種量2%～4%時(shí)，蛋白凝膠強(qiáng)度隨接種量的增加而增強(qiáng)；
接種量4%～6%時(shí)，凝膠強(qiáng)度無(wú)顯著差異；
接種量大于6%時(shí)蛋白凝膠強(qiáng)度反而降低。這是由于乳酸菌接種量少時(shí)，微生物的產(chǎn)酸能力弱，形成凝膠所需的時(shí)間較長(zhǎng)；
而當(dāng)接種量過(guò)高時(shí)，會(huì)影響蛋白質(zhì)之間的聚集，凝膠性降低。
近幾十年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)大豆分離蛋白分子結(jié)構(gòu)及凝膠特性進(jìn)行了廣泛而深入的研究。大豆蛋白凝膠的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受到許多因素共同影響。由于天然大豆蛋白聚集體結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則，二硫鍵含量低，因此其凝膠特性較差，在凝膠食品中的發(fā)展與應(yīng)用一直受到制約。目前可通過(guò)物理、化學(xué)、生物等手段使天然大豆蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性增加，蛋白與蛋白間的非共價(jià)相互作用增強(qiáng)，而非共價(jià)相互作用是凝膠網(wǎng)絡(luò)的“骨架”，因此凝膠性得以提高。但從內(nèi)在因素角度分析，大豆蛋白組分（7S、11S）差異對(duì)凝膠特性的研究尚未深入，蛋白質(zhì)亞基對(duì)功能特性的表達(dá)機(jī)制尚不明晰。在今后的研究中，可在基于擠壓、酶解、超聲等物化改良手段上，將提高蛋白凝膠性與大豆蛋白組分差異性聯(lián)系起來(lái)，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)一步深入研究后，轉(zhuǎn)向應(yīng)用研究，選擇性培育具有特定蛋白質(zhì)亞基組成的大豆品種并進(jìn)行相關(guān)功能性研究，進(jìn)而制備具有高凝膠性的大豆蛋白凝膠產(chǎn)品。
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