林秀玲，施佳利，章潔琦，潘育松
(安徽理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 淮南 232001)
發(fā)燒和疼痛是疾病中常見(jiàn)的癥狀，治療發(fā)燒的有效藥物IBU直接服用對(duì)胃粘膜有一定的損害，容易引起惡心、嘔吐、食欲不振等癥狀[1]。另外，它的疏水性也限制了藥物的生物利用度，為此選擇合適的載體促進(jìn)IBU在內(nèi)部環(huán)境中實(shí)現(xiàn)緩釋，并產(chǎn)生持久的鎮(zhèn)痛效果是科研工作者追求的目標(biāo)。
天然高分子材料已廣泛應(yīng)用于各類藥物的包裹與遞送，可以提高藥物的生物利用度降低毒副作用。具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的水凝膠[2]，因其生物相容性好，具有水溶脹性等優(yōu)點(diǎn)，使得包埋在水凝膠中的藥物分子活性能夠保持較長(zhǎng)時(shí)間，增強(qiáng)藥物在病灶部位的停留時(shí)間和組織滲透性。海藻酸鈉(Sodium alginate，SA)是一種天然多糖，主要來(lái)源于某些細(xì)菌或褐藻。海藻酸鈉優(yōu)異的凝膠形成能力和pH敏感性使SA成為一種被廣泛研究的口服藥物給藥載體[3]。然而單一的海藻酸鈉凝膠孔徑大，對(duì)疏水性藥物負(fù)載量低[4]，限制了其在藥物釋放領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。為了克服這個(gè)問(wèn)題，采用混合的方法制備海藻酸鈉基復(fù)合水凝膠，復(fù)合水凝膠作為疏水藥物IBU載體，控制IBU釋放[5-7]。各種復(fù)合組分中，纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，是地球上最豐富的天然聚合物[8]，來(lái)源于陸生植物、藻類和真菌等可再生資源。根據(jù)不同的原料和加工方法，纖維素主要包括纖維素納米晶(Cellulose nanocrystals，CNCs)、纖維素納米纖維(Cellulose nanofibers，CNFs)、細(xì)菌纖維素(Bacterial nanoellulose，BNC)和其他納米/微米尺度的纖維素[9]。其中，CNFs是一種直徑為5～50nm、長(zhǎng)度為數(shù)微米[10]相互纏繞形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的纖維，可以在水溶液中形成凝膠[11-12]，具有良好的柔韌性、生物相容性和生物降解性，有利于生物材料的發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域[13]。
文章采用CNFs復(fù)合SA制成的水凝膠球作為疏水性IBU的載體，SA在氯化鈣(CaCl2)溶液中形成凝膠的條件溫和，可以避免藥物失去活性。對(duì)CNFs/SA復(fù)合水凝膠球的形貌進(jìn)行表征，并探討CNFs對(duì)水凝膠的成型性和溶脹性的影響，進(jìn)而研究復(fù)合水凝膠球中CNFs含量對(duì)IBU釋放性能的影響。CNFs/SA復(fù)合水凝膠藥物載體有望改善胃部酸性環(huán)境對(duì)口服給藥的影響，達(dá)到對(duì)藥物緩釋的作用。
1.1 試劑與儀器
試劑：海藻酸鈉購(gòu)于福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純，粘度范圍為1.05～1.15Pa·s；
纖維素納米纖維購(gòu)于北方世紀(jì)(江蘇)纖維素材料有限公司，純度99.9%，結(jié)晶度≥75%；
IBU購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥98%；
氯化鈣購(gòu)于無(wú)錫市展望化工試劑有限公司，純度≥96%；
氫氧化鈉(NaOH)購(gòu)于上海沃凱生物科技有限公司，純度≥96%；
生理鹽水購(gòu)于安徽雙鶴藥業(yè)有限公司。
儀器：電子天平(YP-B2003，上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；
42步進(jìn)電機(jī)微型蠕動(dòng)泵(LHZWOO5，惠州市聯(lián)合眾為科技有限公司)；
數(shù)顯高溫磁力攪拌器(90-2，常州越新儀器制造有限公司)；
微量進(jìn)樣器(100μL，上海高鴿工貿(mào)有限公司)；
紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Spectrumlab 752Pro，上海棱光技術(shù)有限公司)；
冷凍干燥機(jī)(LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；
恒溫?fù)u床(ZQTY-70，上海知楚儀器有限公司)。
1.2 CNFs/SA復(fù)合凝膠球的制備
分別稱量4組0.6g海藻酸鈉于20mL去離子水中，將裝有海藻酸鈉和去離子水的燒杯放在65℃的水浴中，充分?jǐn)嚢?h。攪拌完全后滴入3種不同比例的纖維素納米纖維，在37℃的水浴中充分?jǐn)嚢?h，獲得海藻酸鈉纖維素混合液。其中，CNFs液體的固態(tài)藥物的占比為1.34%。稱量一定質(zhì)量的IBU，使IBU占混合液中固含量的10%。將IBU分別添加到上述混合溶液中，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?h。
稱量5g氯化鈣和100mL去離子水，攪拌配制成5%的氯化鈣溶液備用。使用微型蠕動(dòng)泵將混有IBU的CNFs/SA溶液按轉(zhuǎn)速25r·min-1滴加到氯化鈣溶液中，采用離子交聯(lián)法[14]形成載藥的海藻酸鈣基水凝膠球。樣品形成后需在氯化鈣溶液中浸泡一段時(shí)間使形狀保持穩(wěn)定(見(jiàn)圖1、表1)。
圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖
表1 實(shí)驗(yàn)原料配比
1.3 CNFs/SA復(fù)合凝膠球結(jié)構(gòu)表征
用相機(jī)記錄凝膠球的宏觀形貌。
使用日立3 400N掃描電子顯微鏡對(duì)冷凍干燥后的凝膠球斷面進(jìn)行表征，所有樣品需噴金處理。樣品采用傅里葉紅外光譜(FTIR)進(jìn)行表征，ATR附件，掃描范圍為500～4 000cm-1。
1.4 CNFs/SA復(fù)合凝膠球的溶脹率
取一定質(zhì)量的復(fù)合水凝膠球，記為Wd，室溫條件下，浸入12.5mL的生理鹽水中。由少量NaOH調(diào)節(jié)氯化鈉生理鹽水的pH為7.4，以此來(lái)模擬人體內(nèi)環(huán)境液[15]。從凝膠球浸入溶液時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，按照一定時(shí)間間隔將凝膠球從溶液中取出，吸去表面水分并稱重，吸水后凝膠球質(zhì)量記為Ws。溶脹率的計(jì)算公式如下
(1)
1.5 體外藥物釋放性能測(cè)試
1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱量0.02g IBU，放入20mL pH為7.4的溶液中，攪拌之后用微量進(jìn)樣器取樣，利用濃度稀釋公式將溶液分別稀釋成5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL和30μg/mL不同濃度的溶液，轉(zhuǎn)移到容量瓶中，然后用去離子水定容到10mL，搖勻，備用。
所用藥品IBU的紫外吸光度最大吸收峰位于264nm處[16]，故選擇264nm作為本實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定的波長(zhǎng)。對(duì)上述濃度的溶液進(jìn)行測(cè)定，橫坐標(biāo)(X)設(shè)為濃度，縱坐標(biāo)(Y)設(shè)為吸光度，繪制得到IBU在釋放液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。
圖2 IBU在釋放液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線
2)IBU釋放量的測(cè)試 將載藥凝膠球放入含有40mL釋放液(pH=7.4)的錐形瓶中，恒溫振蕩，溫度為38℃，振蕩速率為30rpm。定時(shí)移取3mL的釋放液進(jìn)行吸光度測(cè)試。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度換算成濃度，如圖3所示。累積釋放量的計(jì)算按照公式(2)計(jì)算。
圖3 藥物釋放測(cè)試流程圖
(2)
式中：a為紫外分光光度計(jì)吸光度經(jīng)換算后所得的濃度，μg·mL-1；
b為IBU的藥物含量百分比，%；
c為海藻酸鈉載藥水凝膠球的質(zhì)量，mg。
2.1 復(fù)合凝膠球的宏觀形貌分析
圖4為不同比例CNFs改性SA復(fù)合凝膠球的光學(xué)照片。單純SA載藥凝膠球和CNFs/SA復(fù)合載藥凝膠球均有不同程度的透明。隨著CNFs含量增加，凝膠球透明度降低，凝膠球整體呈白色，成型性及力學(xué)性能提高。
(a) 0%；
(b) 12%；
(c) 21%；
(d) 35%
2.2 復(fù)合凝膠球的微觀形貌分析
藥物釋放前的復(fù)合凝膠球微觀形貌如圖5所示，可以明顯地看到凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。a圖是純SA凝膠斷面結(jié)構(gòu)，凝膠孔洞較大，加入纖維素后凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，孔隙率增加，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加規(guī)整。但是，隨著CNFs含量的增加，大量的CNFs在水溶液中的溶解性變差，CNFs與SA不完全相容，導(dǎo)致水凝膠中出現(xiàn)團(tuán)聚的CNFs。
(a) 0%；
(b) 12%；
(c) 21%；
(d) 35%
2.3 FTIR分析
利用FTIR對(duì)復(fù)合水凝膠球的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，圖6為凝膠各組分(SA、CNFs和IBU)的紅外譜圖。如圖6所示，紅外圖譜上各個(gè)位置的吸收峰分別對(duì)應(yīng)不同的基團(tuán)，SA在3 385cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)的是O-H官能團(tuán)伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 613和1 420cm-1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)-COO-官能團(tuán)的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰和對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。CNFs在3 335cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)O-H伸縮振動(dòng)峰，2 901cm-1主要與對(duì)稱C-H振動(dòng)有關(guān)，1 636cm-1來(lái)源于吸收的水。在圖6中，CNFs譜圖中1 375cm-1、1 059cm-1、666cm-1處分別與C-O和C-OH的平面外彎曲模式、分子間酯鍵的拉伸振動(dòng)密切相關(guān)；
IBU在3 439cm-1和1 720cm-1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于O-H伸縮振動(dòng)峰和C=O的伸縮振動(dòng)峰。
圖6 SA、CNFs和IBU的紅外光譜圖
圖7是CNFs/SA和載藥CNFs/SA水凝膠球的FTIR譜圖，對(duì)比兩個(gè)譜線可知，復(fù)合水凝膠球中屬于SA的-COO-官能團(tuán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰向左移到更大的波長(zhǎng)處，且峰強(qiáng)度降低，表明復(fù)合水凝膠中Ca2+和-COO-官能團(tuán)之間存在離子結(jié)合作用。另外，CNFs/SA紅外圖譜中3 400cm-1處的吸收峰為SA和CNFs分子內(nèi)氫鍵結(jié)合的O-H伸縮振動(dòng)引起的，當(dāng)加入IBU后，CNFs/SA凝膠中屬于O-H的伸縮振動(dòng)峰向低波數(shù)方向移動(dòng)，表明IBU的加入造成SA和CNFs分子內(nèi)氫鍵的解離，IBU與SA和CNFs之間形成了新的分子間氫鍵。IBU作為物理交聯(lián)劑通過(guò)氫鍵作用與CNFs/SA復(fù)合，IBU的加入促進(jìn)了CNFs/SA凝膠網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。
圖7 CNFs/SA和載藥CNFs/SA水凝膠球的FTIR圖
2.4 復(fù)合凝膠球的溶脹率分析
基于SA的pH敏感性，研究者對(duì)不同pH條件下SA復(fù)合水凝膠的溶脹率進(jìn)行了研究[17-18]。為研究水凝膠球中IBU的釋放行為，將未干燥的復(fù)合水凝膠球放入pH7.4的生理鹽水中浸泡，測(cè)試CNFs含量對(duì)SA凝膠球溶脹率的影響(見(jiàn)圖8)。由圖8中曲線可以看到，12h之內(nèi)，純SA水凝膠球的溶脹比最高，加入CNFs后水凝膠球的溶脹率略有降低，這是因?yàn)镃NFs分子中的羥基易形成大量的分子內(nèi)和分子間氫鍵，纖維相互纏繞，水分子進(jìn)入分子鏈內(nèi)部相對(duì)困難[19]，所以加入CNFs不能增加水凝膠球的溶脹率。但是純SA水凝膠球在溶脹過(guò)程中凝膠網(wǎng)絡(luò)坍塌較早，凝膠球容易破碎，穩(wěn)定性最差。加入CNFs后凝膠球的在生理環(huán)境液中的穩(wěn)定性提高。當(dāng)CNFs含量為21%時(shí)，所得CNFs/SA水凝膠球的穩(wěn)定性最好。從圖8中凝膠球的光學(xué)照片看出，溶脹后與溶脹前相比，凝膠球體積明顯增大，吸水后透明性增加。
圖8 不同CNFs含量復(fù)合水凝膠球的溶脹曲線和光學(xué)照片
2.5 復(fù)合凝膠球的藥物釋放行為研究
1)不同CNFs含量復(fù)合凝膠球釋藥分析 CNFs/SA復(fù)合載藥水凝膠球在pH7.4的生理鹽水中震蕩，IBU的釋放曲線如圖9所示。水凝膠球可以吸收周圍的液體介質(zhì)并膨脹(見(jiàn)圖8)，藥物在凝膠載體中的活動(dòng)能力增加，通過(guò)擴(kuò)散作用實(shí)現(xiàn)藥物的釋放。隨著釋放時(shí)間的增加，凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在一定程度的坍塌，隨后藥物的釋放是通過(guò)釋放液對(duì)復(fù)合凝膠球的溶蝕作用實(shí)現(xiàn)[20]。對(duì)比圖9中4條曲線可知，水凝膠載體對(duì)IBU的釋放起到緩釋作用。隨著釋放時(shí)間的增加，IBU的累積釋放量持續(xù)增加。純SA水凝膠球中IBU累積釋放量在5～30h內(nèi)最低。CNFs的加入可以改變水凝膠球載體對(duì)IBU的釋放行為，隨著CNFs含量的增加，IBU的累積釋放量增大，當(dāng)CNFs含量為35%時(shí)，IBU釋放量的增加已經(jīng)減慢，與21%CNFs含量的水凝膠球?qū)BU累積釋放量的影響基本相同。此外，從30～36h內(nèi)的釋放曲線可知，隨著釋放時(shí)間的延長(zhǎng)，4條曲線越來(lái)越接近，IBU在含有CNFs的水凝膠球載體中的累計(jì)釋放量增加緩慢。
可見(jiàn)， 純SA水凝膠球的部分溶蝕加速了IBU的釋放。然而，在釋放液pH值為7.4時(shí)，鈣交聯(lián)的海藻酸鈉凝膠球的膨脹最小，所以在有限的時(shí)間內(nèi)累計(jì)釋放量不高。
圖9 不同CNFs含量復(fù)合凝膠球累積釋藥量
2)釋藥后的微觀形貌 IBU釋放36h后，水凝膠球的微觀形貌如圖10和圖11所示。從圖10可知，水凝膠球在釋放液中浸泡一定時(shí)間后，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加清晰，凝膠骨架壁變薄。對(duì)比圖10中a、b、c和d，含有21% CNFs的凝膠網(wǎng)絡(luò)最規(guī)整，這也驗(yàn)證了CNFs的加入可以提高SA水凝膠球的力學(xué)性能，在釋放液中的穩(wěn)定性提高。
(a) 0%；
(b)12%；
(c) 21%；
(d) 35%
圖11的a和b圖中，凝膠骨架表面可以看到小方塊顆粒，通過(guò)形貌對(duì)比，認(rèn)為這些顆粒是釋放液生理鹽水中的NaCl顆粒[21]。隨著纖維素含量的增加，NaCl顆粒減少，當(dāng)CNFs含量為21%和35%時(shí)，凝膠骨架表面已看不出NaCl顆粒。實(shí)驗(yàn)用到的釋放液是NaOH和生理鹽水的混合溶液，NaOH用來(lái)調(diào)整生理鹽水的pH。CNFs/SA復(fù)合水凝膠球經(jīng)過(guò)釋放液的浸泡和冷凍干燥后，CNFs可以在釋放液中發(fā)生凍融[22]。在較低的溫度下，NaOH中的陰離子OH-破壞纖維素納米纖維之間的氫鍵。與此同時(shí)，陽(yáng)離子Na+協(xié)助斷鍵過(guò)程，防止CNFs分子鏈的重新組合[23]。此過(guò)程消耗了Na+的量，使NaCl小方塊顆粒減少。
(a) 0%；
(b)12%；
(c) 21%；
(d) 35%
3)IBU釋放機(jī)理分析 結(jié)合凝膠球的溶脹率和釋藥曲線可得，藥物IBU的釋放可以分為兩個(gè)階段(見(jiàn)圖12)：第一階段，藥物釋放主要依靠溶脹作用。從圖9釋放曲線可知，IBU的累積釋放量在前5h呈現(xiàn)迅速上升的趨勢(shì)，12h之后水凝膠球中的IBU累積釋放量增加速度減慢，但仍舊保持緩慢釋放；
第二階段，IBU的釋放主要依靠水凝膠在釋放液中的溶蝕作用完成[24]。當(dāng)水凝膠球的溶脹達(dá)到一定階段后，水凝膠球會(huì)逐漸破碎，內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)坍塌，包裹在凝膠載體中的IBU逐步釋放。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，純SA水凝膠球破碎最早。從圖8中溶脹曲線得知，純SA水凝膠的吸水率最大。在相同的時(shí)間內(nèi)，溶脹率大的凝膠球吸水量大，凝膠網(wǎng)絡(luò)最先坍塌，凝膠球最早破碎。因?yàn)榻菰卺尫乓褐械乃z球數(shù)量及大小不等，所以累計(jì)釋放量會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)，圖9中的釋放曲線發(fā)生多個(gè)轉(zhuǎn)折。CNFs的加入可以改善海藻酸鈉水凝膠球中IBU的釋放行為，IBU的釋放仍然按照上述兩個(gè)階段實(shí)現(xiàn)。雖然在有限的時(shí)間內(nèi)，CNFs可以促進(jìn)IBU的釋放，但由于CNFs和SA混合后形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)規(guī)整，CNFs/SA復(fù)合凝膠球在釋放液中浸泡36h后網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)仍然清晰，凝膠球破碎較少，所以CNFs的加入可以維持IBU較長(zhǎng)時(shí)間的釋放，實(shí)現(xiàn)緩釋作用。
圖12 IBU釋放示意圖
由此得出疏水性藥物IBU在CNFs/SA復(fù)合水凝膠球中的釋放機(jī)理：首先復(fù)合水凝膠球發(fā)生溶脹，藥物釋放；
當(dāng)溶脹達(dá)到一定程度時(shí)，復(fù)合水凝膠球表層網(wǎng)絡(luò)坍塌，水凝膠球局部破碎，直至水凝膠球被釋放液完全溶蝕，藥物全部釋放。由于陰離子海藻酸鈉與陽(yáng)離子纖維素之間以及纖維素納米纖維內(nèi)部的相互作用，CNFs會(huì)延長(zhǎng)水凝膠球的溶蝕，從而實(shí)現(xiàn)藥物在CNFs/SA復(fù)合水凝膠球中的緩慢釋放。
采用離子交聯(lián)技術(shù)制備了CNFs/SA復(fù)合水凝膠球，以復(fù)合凝膠球作為疏水性藥物IBU的載體，測(cè)試了復(fù)合水凝膠球的溶脹率，討論了IBU釋放前后水凝膠球的形貌變化，分析了復(fù)合水凝膠球?qū)BU的緩釋作用。CNFs的加入改善了復(fù)合水凝膠球的成型性和溶脹性。CNFs含量為21%時(shí)復(fù)合水凝膠球的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)規(guī)整，在釋放液中的穩(wěn)定性最好，可以維持IBU在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)釋放。CNFs/SA復(fù)合水凝膠球有望成為疏水性口服藥物載體的理想材料。
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