鐘梅芳 馬秋林 李楚凌 盧炫廷
縫隙連接蛋白基因GJB2是導致常染色體隱性遺傳非綜合征型聾的最常見原因[1]。其中，GJB2基因c.109G>A/p.Val37Ile(以下簡稱p.V37I)變異位點，不僅在很多耳聾患者中被檢測出來，也存在于聽力正常的個體中。它廣泛存在于東亞人群中，在我國廣東省人群中的等位基因頻率高達11.61%[2]。p.V37I的耳聾致病性一直備受爭議，但目前已被美國醫學遺傳學與基因組學學會和分子病理學協會(ACMG/AMP)指南明確劃分為耳聾致病變異位點[3]。由于p.V37I相關的聽力表型具有不完全外顯和變異度較大的特點，對經典的孟德爾遺傳病在臨床解釋上提出了重大挑戰[1]。目前，關于GJB2 p.V37I致病變異最普遍存在的廣東人群中的聽力表型信息報道比較少，本研究通過對廣東東莞地區210例攜帶GJB2基因p.V37I純合及復合雜合變異嬰兒的聽力篩查、診斷及隨訪結果進行總結和分析，獲得其聽力表型信息，以進一步了解和評價GJB2 p.V37I基因變異對東莞地區兒童聽力損失的影響，為臨床耳聾基因診斷與遺傳咨詢提供參考。
1.1研究對象 以2018年1月至2021年1月期間，來自東莞地區20家醫院出生的且耳聾基因篩查或測序結果為GJB2基因p.V37I純合或復合雜合變異，并均在東莞市新生兒聽力障礙診治中心接受耳聾遺傳咨詢和聽力檢測的嬰兒210例為研究對象,臨床聽力學資料完整,其中男115例，女95例；
東莞市戶籍123例，省內非本市戶籍24例，外省戶籍63例；
出生時有聽力損失高危因素46例，其中25例有病理性黃疸(未達到換血治療程度)，早產兒5例，新生兒肺炎4例，足月小樣兒3例，宮內感染3例，羊水吸入綜合征3例，3例出生時因母親孕期合并心臟病、重度子癇和膿毒血癥入住新生兒監護病房，其余164例為出生正常嬰兒。
1.2耳聾基因檢測方法 210例出生后均接受了耳聾基因篩查，其中204例(97.14%，204/210)出生后接受了聽力聯合耳聾基因同步篩查，其余6例是在1歲以內聽力學診斷異常后進行了耳聾基因篩查及測序。Sanger測序檢測是使用廣東凱普生物科技股份有限公司的聚合酶鏈式反應技術(PCR)對GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA12SrRNA的4個基因的目標位置進行擴增，并采用特異性引物進行檢測。引物見表1，特異性引物的設計是專門針對目標位點，并覆蓋該位點上下游的序列。對標本檢測得到的序列與NCBI所提供的上述4個基因參考序列，使用生物信息學軟件Alamut Visual 2.11進行比對和注釋。對突變的表述參照HGVS (Human Genome Variation Society) version 15.11進行。
表1 檢測GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA 12SrRNA 4個基因的PCR引物
1.3聽力檢測方法 根據相關指南[4]，對出生后2～3天的新生兒在出生醫院采用耳聲發射(OAE)或自動聽性腦干反應(AABR)完成聽力初篩；
初篩未通過者于出生后42天內轉診至東莞市新生兒聽力障礙診治中心進行復篩，采用畸變產物耳聲發射(DPOAE)和AABR聯合測試；
復篩未通過者于3月齡進行第一次聽力診斷，使用氣導聽性腦干反應(ABR)+聲導抗+DPOAE+行為測聽的基本組合聽力測試；
首次聽力診斷異常者于6月齡進行第二次聽力診斷，根據患兒聽力損失的情況在基本組合聽力測試項目上追加骨導ABR和聽性穩態反應(ASSR)測試等，具體測試設備與參數設置見文獻報道[5]。所有研究對象的基本信息與聽力篩查診斷結果均錄入東莞市新生兒聽力篩查系統，以便對患兒的跟蹤隨訪和數據的統計分析。
1.4聽力診斷標準 參考相關文獻[6]，將嬰兒聽力診斷正常標準定為：①氣導短聲ABR波V反應閾<35 dB nHL；
②1 000 Hz探測音鼓室導抗圖為正峰型；
③DPOAE測試有≥5個頻率點的信噪比≥6 dB，且幅值在正常范圍內；
④行為測聽聽閾參考對應月齡的正常值。依照ABR波V反應閾值，將聽力損失程度劃分為四個等級：輕度(31～50 dB nHL)、中度(51～70 dB nHL) 、重度(71～90 dB nHL)和極重度聽力損失(≥91 dB nHL)。
1.5統計學方法 采用統計學軟件SPSS 20.0對所得數據進行分析，計量資料以頻數(n)或百分率(%)表示，兩組的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。
2.1耳聾基因檢測結果 210例嬰兒中，194例(92.38%，194/210)為GJB2基因p.V37I純合變異，15例(7.14%，15/210)為GJB2基因p.V37I/c.235delC復合雜合變異，1例為GJB2基因p.V37I/c.79G>A/ c.23C>T的3位點復合雜合變異。
2.2聽力檢測結果
2.2.1聽力初篩及復篩結果 210例中，初篩未通過166例(79.05%，166/210),其中146例進行了聽力復篩，未通過共84例(57.14%，84/146)。在兩步篩查中，初篩通過44例和復篩通過62例，共106例(50.48%,106/210)通過聽力篩查。
2.2.2聽力診斷結果 210例(420耳)中，88例進行第一次聽力學診斷，66例(111耳)氣導短聲ABR波V反應閾>35 dB nHL和DPOAE未引出，診斷為聽力異常，其中4例(4耳)耳內鏡檢查顯示中耳腔積液征和1 000 Hz鼓室導抗圖無峰型，其余嬰兒1 000 Hz鼓室導抗圖為有峰型。
第一次聽力診斷異常的66例中55例接受了第二次聽力診斷和相關醫學評估，其中,43例(75耳)(17.86%,75/420)診斷為聽力異常,75耳均為DPOAE未引出和1 000 Hz鼓室導抗圖正峰，其中1例(2耳)ABR測試顯示存在明顯的骨-氣導差,表現為傳導性聽力損失，其余均為感音神經性聽力損失；
67耳(89.33%,67/75)為輕度聽力損失，1例單側和1例雙側(4%,3/75)中度聽力損失，3例單側和1例雙側(6.67%,5/75)為重度及以上聽力損失。對比第一次聽力診斷的結果，第二次聽力診斷為輕度聽力損失的人數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。
表2 66例GJB2基因p.V37I純合及復合變異嬰兒不同聽力損失程度在二次聽力診斷的分布(耳,%)
2.2.3聽力損失較重病例的隨訪結果 本研究最終共檢出6例(8耳)中度及以上聽力損失患兒，其中2例單側聾患兒尚未完善耳聾基因診斷及影像學評估，4例接受了Sanger測序分析和內耳MRI或顳骨CT檢查，最后一次的聽力隨訪結果如下。
病例1：男，無聽力損失高危因素，聽力初復篩雙耳均未通過，3月齡和6月齡時，左側氣導ABR反應閾100 dB nHL未引出,右側100 dB nHL，ASSR預估聽力圖(圖1a)為雙耳極重度感音神經性聽力損失。基因篩查和Sanger測序分析為GJB2基因p.V37I純合變異，內耳MRI平掃MRN(圖2a1和2a2)示左側前庭擴大并與水平半規管融合，右側前庭稍擴大和半規管稍擴張，考慮先天性發育畸形。于7月齡時已行右側人工耳蝸植入術。
病例2：女，無聽力損失高危因素，聽力初復篩左耳未通過，3月齡和6月齡時診斷為左耳重度感音神經性聽力損失,左側氣導ABR反應閾90 dB nHL,ASSR預估聽力圖呈明顯高頻陡降型(圖1b)。基因篩查和Sanger測序分析為GJB2基因p.V37I純合變異和GJB3基因c.357C>T雜合變異，內耳MRI(圖2b1和2b2)發現左側蝸神經未顯示，左側耳蝸頂回略小。目前，該患兒未行任何聽力干預。
病例3：男，無聽力損失高危因素，聽力初復篩雙耳均未通過，3月齡和7月齡時,雙側氣導ABR測試時引出聲誘發短潛伏期負反應波(ASNR)，且存在約30～40 dB的氣-骨導差(圖1c1和1c2)，ASSR預估聽力圖為雙耳中度聽力損失(圖1c3)。基因篩查和Sanger測序分析為GJB2基因p.V37I純合變異和SLC26A4基因c.2086C>T雜合變異，顳骨CT掃描(圖2c1和2c2)發現雙側大前庭水管增寬，并直接與總腳相遇，雙側耳蝸發育異常，診斷為大前庭水管綜合征(LVAS)，目前雙耳佩戴助聽器和進行言語康復訓練。
病例4：女，出生時有病理性黃疸行藍光治療，聽力初篩左耳未通過,右耳通過，復篩雙耳均未通過;1歲時左側氣導ABR反應閾55 dB nHL，右側45 dB nHL，ASSR預估聽力圖為左耳中度和右耳輕度聽力損失(圖1d)。基因篩查和Sanger測序分析為GJB2基因p.V37I純合突變，顳骨CT平掃+重建未見明顯異常。目前，該患兒未行任何聽力干預。
圖1 4例患兒的聽力測試圖 a.患兒1的ASSR; b.患兒2的ASSR; c1.患兒3的氣導ABR; c2.患兒3的骨導ABR; c3.患兒3的ASSR; d.患兒4的ASSR
圖2 3例患兒的影像學圖像 a1.患兒1內耳MRI平掃MRN顯示左側前庭擴大并與水平半規管融合(短箭頭),右側前庭稍擴大(長箭頭); a2.患兒1右側半規管稍擴張(長箭頭); b1.患兒2 MRI斜矢狀面內耳道成像顯示左側內耳道未見蝸神經(長箭頭); b2.患兒2右側內耳道蝸神經(長箭頭); c1.患兒3顳骨CT掃描顯示雙側前庭水管增寬(長箭頭); c2.患兒3雙側前庭直接與總腳相遇(長箭頭),雙側耳蝸發育異常
GJB2基因位于人類染色體13q11-12，含有2個外顯子，編碼的縫隙連接蛋白26(Cx26)屬于完整膜蛋白的連接蛋白家族，對耳蝸支持細胞的功能至關重要。當發生DFNB1位點突變，無論是純合或復合雜合突變，使GJB2基因的兩個等位基因失活，導致常染色體隱性遺傳性聾[7]。GJB2是一個小基因，但有很多突變。至今為止，已發現有200多個GJB2變異位點與常染色體隱性遺傳非綜合征型聾相關，其常見的突變熱點往往存在明顯的種族差異，而且不同突變的聽力表型可能差異很大[7]。GJB2基因p.V37I剛開始被認為非致病突變[8]，然而大量研究已證實它是一個廣泛存在于東亞人群的致病變異[9]，目前已獲得我國藥品監督管理局(NMPA)批號的耳聾基因篩查試劑盒中的變異位點[10]。
研究表明[11,12]，p.V37I變異是GJB2基因非截斷突變中的錯義突變，僅導致耳蝸外毛細胞微小損失或蛋白功能部分降低，但大體上不影響耳蝸細胞的結構及縫隙連接蛋白的形成與定位，故p.V37I的致病性和外顯率較低。本研究發現210例GJB2基因p.V37I純合及復合雜合變異嬰兒中，有106例(50.48%，106/210)可通過兩步篩查;以往研究[13-15]亦報道p.V37I純合或復合雜合變異嬰兒聽力篩查通過率26.67%～53.85%，說明p.V37I變異外顯率較低，尤其在新生兒聽力篩查中存在一定比例的“不外顯”。另外，本組對象中有22例p.V37I變異攜帶者兩次聽力篩查皆未通過但第一次聽力學診斷為正常;還有12例雖然首次聽力診斷為輕中度聽力損失但第二次聽力診斷為正常，尤其是輕度聽力損失者的比例較多。推測可能由于出生后外中耳殘留羊水、胎脂或發生常見的嬰兒分泌性中耳炎，經過治療或自愈后中耳功能改善從而聽力好轉；
也可能存在低月齡嬰兒聽覺功能發育遲緩，隨著月齡增長聽力隨之改善。
p.V37I變異不僅外顯率較低，且引起的聽力損失主要為輕度至中度感音神經性聽力損失[14-17]。本研究中，經過“兩次診斷”后確診為聽力損失者43例(75耳)，檢出率為17.86%(75/420)，與Chai等[18]推斷p.V37I純合突變約有17%的外顯率接近。這75耳聽力損失耳中，輕度聽力損失67耳(89.33%，67/75)，而中度聽力損失僅3耳(4%，3/75)，比既往文獻報道的聽力損失程度及比例要低，可能與本研究對象的地區不同及年齡較小等有關。
p.V37I變異引起的聽力表型變異較大，可為聽力正常，也可為輕度至極重度感音神經性聽力損失，但發生嚴重聽力損失的比例較少[18]。本研究僅發現6例(8耳)中度及以上聽力損失嬰兒，隨訪中發現3例同時攜帶其他基因變異或合并內耳或神經發育畸形。Del等[7]的文獻綜述表明GJB2基因DFNB1聽力損失患者中較少出現顳骨畸形，其患病率通常低于10%。因此，考慮個別嚴重聽力損失的p.V37I變異病例可能是由于存在其他基因變異或病因，建議進行分子遺傳學和影像學等全面評估。
綜上所述，本組東莞地區攜帶GJB2基因p.V37I純合及復合雜合變異的嬰兒中，聽力損失的檢出率為17.86%，聽力表型外顯率較低，而且變異較大。值得關注的是，已有不少文獻[13，14]報道p.V37I變異與兒童遲發性和漸進性聽力損失有關。因此，在臨床中須重視包括p.V37I基因在內的遺傳性聾易感基因篩查，對基因變異攜帶者即使通過聽力篩查或聽力正常也應注意隨訪，動態監測其聽力。但是，由于本研究對出生后一年內嬰兒的耳聾基因篩查和聽力資料進行總結與分析，大多數研究對象有待進一步完善耳聾基因診斷及主觀行為測聽等相關檢查來驗證其基因型與聽力表型的相關性;今后還需進行持續的聽力隨訪，以期為臨床咨詢提供更準確的依據。
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