李 杰，黃曉宇，尚學峰，楊姣姣，張娟麗，謝開會，張亞麗，閆尊強，王鵬飛，高小莉，楊巧麗，馬艷萍，滾雙寶，3
(1.甘肅農業大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；
2.甘肅農業大學圖書館，甘肅 蘭州 730070；
3.甘肅省現代養豬技術工程研究中心，甘肅 蘭州 730070)
我國作為世界第一大花椒生產國，花椒種植歷史悠久，品種齊全，種植面積超過113萬hm2，主產區產量超過37萬t[1-2]。花椒果皮常用作調味品，花椒籽為花椒的主要副產品，占花椒總質量的60%以上[3]，花椒籽油中富含脂質和蛋白質，多不飽和脂肪酸種類多且含量高[4-5]。李路路[6]研究發現，花椒籽油中多不飽和脂肪酸高達85%。隨著人們生活水平的不斷提高，對豬肉品質有了更高的要求，肌內脂肪、脂肪酸含量是評價肉品質的指標，直接影響著肉的風味和口感。然而，豬肉中多不飽和脂肪酸的合成需要中間產物(亞油酸、α-亞麻酸等)，且胴體中的脂肪酸含量與飼料有直接關系[7]。花椒籽中富含油酸、亞油酸、a-亞麻酸、棕櫚酸等脂肪酸[8]，是豬從飼料中獲取脂肪酸較為理想的來源，在飼料工業中具有較好的利用價值。近年來，對花椒籽的開發利用方面研究炙熱，已有學者在雞[9]、魚[6]、豬[10]上進行試驗，研究均表明，在日糧中添加一定比例的花椒籽粉可提高動物生產性能。由此可見，花椒籽可在飼料行業開發利用，它的合理利用有望節約生產成本和提高經濟效益，解決花椒生產中副產品浪費的問題。
脂肪酸結合蛋白2基因(Fatty acid-binding protein 2 gene，FABP2)，蛋白分子質量較小(14～15 ku)，屬于脂肪酸結合蛋白家族(FABPs)[11]，該家族基因大多含有多態性位點，通過調節脂肪酸代謝途徑來提高肉品質，其多態性位點間接影響肌內脂肪含量[12-13]，FABPs的這種生物學功能對豬肉肌內脂肪沉積有潛在影響。肌內脂肪是豬肉品質評定的一項重要指標[14]，其含量影響肉的風味。現階段育種對豬肉肌內脂肪含量要求較高，如何增加肌內脂肪含量、提高肉品質，是當今育種工作者的目標和難點。而FABP2與體內脂肪沉積相關聯，可作為影響肌內脂肪含量的候選基因，主要參與哺乳動物長鏈脂肪酸的運輸和吸收，影響脂類代謝[15-16]。其次可以通過調節參與脂質代謝的基因和提高脂肪酸水溶性來促進腸道對多不飽和脂肪酸的吸收[17-18]。除此之外，FABP2基因還與膽汁酸和維生素具有較高的親和力[19]，這表明FABP2具有極其重要的生理作用。
為了尋找與豬脂肪沉積有關的基因，本試驗通過研究FABP2在不同比例花椒籽飼喂育肥豬中的組織差異表達，以及對其編碼區進行克隆及生物信息學分析，以期為花椒籽的開發利用和FABP2基因作為肌內脂肪沉積候選基因的相關研究提供參考依據。
1.1 樣品采集
本試驗所用組織樣為畜牧學養豬產業技術創新團隊前期試驗保存[10]。試驗對象為288頭90日齡杜×長×大三元雜交育肥豬(33 kg)，由臨夏州眾惠豬業科技有限公司提供，將其隨機分為4組，每組設4個重復，每個重復18頭豬；
對照組飼喂基礎日糧，各試驗組分別用花椒籽代替飼糧中2.5%(試驗Ⅰ組)、5.0%(試驗Ⅱ組)、7.5%(試驗Ⅲ組)的玉米，預試驗7 d，正試期100 d。試驗結束后，屠宰豬只，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、盲腸和背肌組織，液氮迅速冷凍，-80 ℃超低溫冰箱長期保存。
1.2 試驗主要試劑
TRIzol試劑購自北京全式金生物技術有限公司，Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix購自武漢賽維爾生物科技有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購自擎科生物公司(西安)，2×Taq PCR Master Mix和DH5α感受態細胞購自北京天根生化科技有限公司，pMDTM19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司，其他常用國產分析純試劑。
1.3 總RNA提取及反轉錄
用TRIzoL提取豬各組織中總RNA，用Evo M-MLV 反轉錄預混型試劑盒合成cDNA，具體步驟如下：①去除基因組DNA，反應體系10 μL，其中5× gDNA Clean Reaction Mix 2 μL，Total RNA 2 μL，RNase free water 6 μL，反應條件為42 ℃，2 min；
4 ℃保存。②反轉錄反應，步驟①反應液10 μL，5× Evo M-MLV RT Reaction Mix 4 μL，RNase free water 6 μL，總體系20 μL。反應條件：37 ℃，15 min；
85 ℃，5 s；
4 ℃保存。反應結束后，測定cDNA濃度，-20 ℃保存備用。
1.4 FABP2引物設計與合成
根據NCBI GenBank數據庫中豬的FABP2基因參考序列(NM_001031780.1)、內參基因GAPDH參考序列(NM_001206359.1)，利用Primer 5.0在線軟件分別設計特異性擴增引物，由中科羽瞳生物科技有限公司合成(表1)。
表1 引物信息Tab.1 Primers information
1.5 FABP2的表達檢測
以3個處理組中不同組織的cDNA為模板，采用qRT-PCR檢測FABP2基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、盲腸和背肌各組織及各試驗組的相對表達量，qRT-PCR反應總體系為20 μL：2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；
95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環。每組設3個重復，以2-ΔΔCt法[20]計算相對表達量。
1.6 三元雜交育肥豬FABP2基因克隆及測序
PCR產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化，將膠回收cDNA與pMDTM19-T Vector載體連接，連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，加入不含Amp的LB培養基中。搖床振蕩培養1 h后，取適量菌液涂到含Amp、IPTG和X-Gal的LB固體培養基上，進行藍白斑篩選。接著挑取單個白色菌落置于LB(含Amp)液體培養基中，搖床振蕩培養4～5 h。經菌液PCR擴增，將陽性克隆菌液送至西安擎科生物公司進行測序。
1.7 生物信息學分析
本試驗通過多種生物信息學軟件對克隆得到的三元雜交育肥豬FABP2基因的CDS區進行分析。所用在線軟件及程序見表2。
1.8 數據處理
2.1 FABP2基因在三元雜交育肥豬各組織差異表達
由圖1可知，FABP2在三元雜交育肥豬各組織中均有不同程度表達，在空腸中顯著高表達(P<0.05)，背肌中表達量最低。但是總體來說在腸道組織的表達量較高。用不同比例花椒籽替代部分玉米飼喂三元雜交育肥豬后，與對照組相比，各試驗組在心臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸和盲腸組織中，FABP2顯著下調表達(P<0.05)；
脾臟和回腸組織中，FABP2在試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組中顯著上調表達(P<0.05)；
肝臟、結腸、直腸組織中，FABP2在試驗Ⅰ組顯著上調表達(P<0.05)；
FABP2在各試驗組不同組織中的表達無明顯規律(圖2)。
表2 生物信息學分析軟件Tab.2 Bioinformatics analysis software
不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.2.
圖2 FABP2基因在不同比例花椒籽飼喂三元雜交育肥豬的組織差異表達Fig.2 FABP2 gene was differentially expressed in tissues of DLY fattening pigs fed with different proportions of Zanthoxylum seed
2.2 三元雜交育肥豬FABP2基因CDS區PCR擴增及克隆測序
用TRIzol法提取三元雜交育肥豬回腸組織的總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得一條427 bp的特異性條帶，與預期片段大小一致(圖3)。測序結果表明，FABP2基因序列全長427 bp，包括5′UTR區10 bp，3′UTR區18 bp和CDS區399 bp，編碼132個氨基酸，其中152位點處的堿基A突變為G(圖4)，導致第51位點的賴氨酸突變為精氨酸；
核苷酸序列308位點的堿基T突變為C，導致第103位點的亮氨酸突變為絲氨酸，均為錯義突變(圖5)。
M.DNA Marker DL2000；
1，2.FABP2基因PCR擴增產物。M.DNA Marker DL2000 ；
1，2.PCR amplification product of FABP2 gene.
2.3 同源性分析及系統進化樹的構建
用NCBI中的Blast在線軟件，分析克隆所得三元雜交育肥豬FABP2CDS區序列與其他物種CDS區序列的同源性，結果顯示，三元雜交育肥豬FABP2CDS區序列與綿羊(XM_004009588.5)、馬(NM_001081903.2)、牛(NM_001025332.1)、犬(XM_038444525.1)、智人(NM_000134.4)、獼猴(XM_015139143.2)、小鼠(NM_007980.3)、大鼠(NM_013068.1)、雞(NM_001007923.2)的同源性分別為87.72%，83.33%，87.47%，88.97%，85.96%，86.97%，79.39%，81.42%，72.08%。其中，三元雜交育肥豬與綿羊親緣關系最近，與雞親緣關系最遠，利用MEGA 7.0軟件計算不同物種間的遺傳距離(表3)并構建系統進化樹(圖6)，分析結果與同源性比對相吻合。
圖4 測序結果分析Fig.4 Analysis of sequencing results
圖5 氨基酸序列比對Fig.5 Alignment of amino acid sequences
2.4 三元雜交育肥豬FABP2蛋白理化性質分析
用ProtParam軟件預測三元雜交育肥豬FABP2蛋白的理化性質，預測結果顯示，分子式為C677H1066N186O205S4，分子質量為15.219 27 ku，原子總數為2 138，理論等電點(pI)為6.61，偏酸性；
其中天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)和賴氨酸(Lys)所占比例最高(9.80%)，組氨酸(His)最低(0.80%)(圖7)；
哺乳動物網織紅細胞體外估計半衰期為30 h，大腸桿菌體內半衰期大于10 h，酵母體內大于20 h；
消光系數(γ=280 nm)為16 960；
脂肪族氨基酸指數為78.94，不穩定指數(Ⅱ)為25.92，表明該蛋白是穩定蛋白。
2.5 三元雜交育肥豬FABP2蛋白二三級結構預測
采用在線軟件SOMPA預測三元雜交育肥豬FABP2蛋白二級結構，結果顯示(圖8)，FABP2蛋白的二級結構主要由延伸鏈和無規則卷曲構成，其中延伸鏈占37.12%，由49個氨基酸殘基組成；
無規則卷曲占32.58%，由43個氨基酸殘基組成；
α-螺旋占18.94%，由25個氨基酸殘基組成；
β-轉角占11.36%，由15個氨基酸殘基組成。用Phyre2在線軟件通過同源建模法構建三元雜交育肥豬FABP2蛋白三級結構模型，預測結果與二級結構預測一致。同時對其親緣關系最近的綿羊和最遠的雞構建模型，三元雜交育肥豬三級結構與綿羊相比差異較小，雞延伸鏈和無規則卷曲所占比例均低于三元雜交育肥豬，表明二者蛋白在三級結構上存在差異，在生物體內發揮的作用也有所不同，但三者的三級結構都主要由延伸鏈和無規則卷曲構成，這也是氨基酸序列保守性的原因(圖9)。
表3 不同物種間遺傳距離Tab.3 Genetic distance between different species
圖6 不同物種FABP2基因系統進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of FABP2 gene in different species
圖7 氨基酸組成及頻率Fig.7 Amino acid composition and frequency
h.α-螺旋；
t.β-轉角；
c.無規則卷曲；
e.延伸鏈。h.α-helix；
t.Beta angle；
c.Random crimp；
e.Extension chain.
A.三元雜交育肥豬；
B.綿羊；
C.雞。A.DLY fattening pigs ；
B.Sheep ；
C.Chicken.
2.6 三元雜交育肥豬FABP2蛋白親疏水性和跨膜區分析
運用ExPASy在線軟件Protscale對三元雜交育肥豬FABP2氨基酸序列進行親疏水性分析(圖10-A)，氨基酸序列中，第14位出現最小疏水值(-2.711)，第65位出現最大疏水值(1.967)，親水性氨基酸占比(65%)高于疏水性氨基酸(35%)。可推測三元雜交育肥豬FABP2蛋白為親水性蛋白。用在線軟件TMHMM預測跨膜螺旋區域(圖10-B)，預測期望值為0，表明該蛋白不存在跨膜區，為非跨膜蛋白，主要在細胞質中發揮作用。
2.7 三元雜交育肥豬 FABP2 蛋白亞細胞定位和信號肽分析
用PSORT Ⅱ Prediction對蛋白亞細胞定位分析，結果表明(圖11-A)，該蛋白在細胞質(56.50%)、細胞核(30.40%)、線粒體(8.70%)和過氧化物酶體(4.30%)中發揮作用；
SignalP 4.1預測信號肽，結果表明，信號肽S預測均值為0.104，該蛋白不具有信號肽，可推測為非分泌蛋白(圖11-B)。
圖10 FAPB2親疏水性分析(A)和跨膜螺旋結構域預測(B)Fig.10 FAPB2 hydrophobicity analysis(A)and transmembrane helical structure domain prediction(B)
圖11 蛋白亞細胞定位(A)和信號肽預測(B)Fig.11 Protein subcellular localization(A)and signal peptide prediction(B)
2.8 三元雜交育肥豬 FABP2 蛋白激酶磷酸化和N端糖基化位點分析
利用NetPhos 3.1 Server 在線軟件預測三元雜交育肥豬FABP2蛋白的激酶磷酸化修飾位點(圖12-A)，預測到絲氨酸在53(2個)，54，72，103位點出現磷酸化位點，得分分別為0.692，0.503，0.993，0.502，0.520；
蘇氨酸在42，49(2個)，55，80，105(2個)位點出現磷酸化位點，得分分別為0.573，0.817，0.779，0.662，0.508，0.855，0.507；
酪氨酸在15位出現活躍位點，得分為0.788，該蛋白的激酶位點有DNAPK、PKC、PKA、CKI、CKII，共5種(表4)。
NetNGlyc預測三元雜交育肥豬N端糖基化位點(圖12-B)，預測值(0.554 6)大于0.5，預測結果可靠，氨基酸序列中，在70位點存在1個潛在的N端糖基化位點。
圖12 激酶磷酸化位點(A)和N-端糖基化位點預測(B)Fig.12 Kinase phosphorylation site(A)and N-terminal glycosylation site prediction(B)
表4 三元雜交育肥豬FABP2蛋白可能的磷酸化位點Tab.4 Possible phosphorylation sites of FABP2 protein in DLY fattening pigs
2.9 三元雜交育肥豬FABP2蛋白的保守結構域和折疊無序化分析
NCBI中預測到2～131位點含有一個Lipocalin-FABP2超家族保守結構域，是脂質運載蛋白(圖13)。運用FoldIndex進行固有無序化分析，存在3個無序化區域，分別在1～35，90～102，105～132區段，所含氨基酸數分別為35，13，28個，未折疊氨基酸總數76個(圖14-A)。與親緣關系最遠的雞比較，雞在1～35區域存在含35個氨基酸的1個無序化區域，存在很大差異(圖14-B)。與親緣關系最近的綿羊比較，綿羊存在1個無序化區域，無序化區域與雞相同，表明不同物種的蛋白質發揮的功能有所不同(圖14-C)。
FABPs家族成員現已發現至少9種，該家族成員的基因結構基本相同[21]，均屬于低分子量的細胞內脂質伴侶，在各組織中廣泛表達，主要參與脂肪酸轉運和調控細胞增殖[22]。FABP2蛋白是哺乳動物細胞內的一種可溶性蛋白質[22]，可特異性結合長鏈脂肪酸，吸收膳食脂肪酸[23-24]，參與長鏈脂肪酸的細胞內運輸[25]。此生物學特性對改善肉品質具有潛在價值，可作為體內脂肪沉積的候選基因，在分子育種中前景廣闊。已有學者克隆了斑馬魚[26]和標槍蝦虎魚[22]的FABP2基因，發現該基因編碼132個氨基酸。Larkina等[27]認為，FABP2基因可作為雞腹部脂肪沉積的候選基因，但是有關FABP2基因在三元雜交育肥豬上的研究甚少。
圖13 三元雜交育肥豬FABP2蛋白的保守結構域Fig.13 Conserved domain of FABP2 protein in DLY fattening pigs
A.三元雜交育肥豬；
B.雞；
C.綿羊。A.DLY fattening pigs；
B.Chicken；
C.Sheep.
本試驗成功克隆了三元雜交育肥豬FABP2基因編碼區，全長399 bp，編碼132個氨基酸。通過組織表達譜分析發現，FABP2基因在各組織中廣泛表達，在空腸中相對表達量最高，但背肌中相對表達量最低。飼糧中添加不同比例花椒籽飼喂三元雜交育肥豬后，試驗Ⅰ組和試驗Ⅲ組背肌組織中FABP2顯著上調表達。與對照組相比，空腸中FABP2在各試驗組均顯著下調表達。當添加量為7.5%，三元雜交育肥豬背肌中FABP2表達量顯著高于對照組。該研究結果說明，飼糧中添加花椒籽顯著影響三元雜交育肥豬不同組織中FABP2基因表達水平。Gajda等[28]研究發現，FABP2在哺乳動物空腸中表達量最高，這與本研究結果相似。通過三元雜交育肥豬FABP2氨基酸序列與豬氨基酸參考序列的比對發現，三元雜交育肥豬FABP2氨基酸序列存在2處錯義突變，即152位點處的堿基A突變為G，導致第51位點的賴氨酸突變為精氨酸；
核苷酸序列308位點的堿基T突變為C，導致第103位點的亮氨酸突變為絲氨酸，初步推測這可能是影響豬脂肪沉積的潛在原因之一，但FABP2基因參與脂質代謝的機制尚不明確，有待進一步研究。
同源性分析表明，三元雜交育肥豬與綿羊親緣關系最近，核苷酸序列同源性為87.72%，種間相似性高，說明FABP2蛋白在物種間具有高度保守性。蛋白質磷酸化對蛋白質發揮功能具有極其重要的作用，可通過共價修飾的方式修飾1/3以上的細胞蛋白，蛋白激酶僅對絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3種氨基酸殘基的磷酸化表現出嚴格的特異性[29]。本試驗預測到三元雜交育肥豬FABP2蛋白存在5個絲氨酸位點、7個蘇氨酸位點和1個酪氨酸位點，預測結果合理。此外，還預測到一個N端糖基化位點，蛋白質糖基化大多在膜結合蛋白中分布，這也是影響該蛋白穩定性和功能發揮的原因[30]。FABP2蛋白二級結構主要由延伸鏈和無規卷曲構成，不存在跨膜螺旋結構，是一種親水性非跨膜蛋白，主要在細胞質、細胞核、線粒體和過氧化物酶體中發揮作用。當信號肽位點S均值大于0.5時，才具有潛在的信號肽[31]，三元雜交育肥豬FABP2蛋白信號肽S預測均值為0.104，表明該蛋白不具有信號肽，是非分泌蛋白，主要在胞質中。蛋白質固有無序化在生物體中具有極其重要的意義，是評價蛋白質功能的重要指標之一，與蛋白質生物學特性密切相關[32]。本試驗預測到三元雜交育肥豬存在3個無序化區域，無序化程度高。陳旖婷[33]研究發現，由脂肪細胞分泌的Lipocalin與脂肪沉積有關，三元雜交育肥豬FABP2蛋白在2～131位點含有一個Lipocalin-FABP2超家族保守結構域(脂質運載蛋白)，具有配體結合腔，該研究與本研究結果相似。
本試驗結果表明，不同比例花椒籽替代部分玉米能顯著影響三元雜交育肥豬各組織中FABP2的表達水平，尤其對背肌和空腸組織中的表達影響最為顯著。三元雜交育肥豬FABP2基因CDS序列全長399 bp，共編碼132個氨基酸，其CDS序列存在2處錯義突變，三元雜交育肥豬FABP2基因與綿羊和牛物種同源性較高。三元雜交育肥豬FABP2蛋白為酸性穩定的非分泌蛋白，該蛋白主要以延伸鏈和無規則卷曲構成，該蛋白無序化程度高，主要在細胞質中發揮作用。本試驗結果可為進一步研究FABP2蛋白的生物學特性提供科學依據。
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