葉明彬 馬艷平 梁志凌 馬江耀 馮國清 陳華靈 王付民 麥瑞瓊 劉振興*
(1.廣東惠東海龜國家級自然保護區管理局，惠東，516359；
2.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州，510640)
綠海龜(Cheloniamydas)是海洋生態系統的重要維護者[1-3]，具有極高的科研、觀賞、生態和文化價值。2004年綠海龜被IUCN列為瀕危物種，2007年又被CITES列為附錄Ⅰ，世界自然基金會(WWF)把綠海龜列為瀕危物種，我國也將其列為一級保護動物[4-6]。
綠海龜保護中除需要應對全球變暖導致的種群性別失衡及海平面上升導致的產卵場破壞、海洋垃圾污染、漁業生產導致海洋生物棲息地急劇減少等全球性難題外[7-10]，綠海龜自身還面臨著病毒、細菌、寄生蟲等多種病原的威脅[11-18]，尤其是稚龜，因其自身免疫系統不完善，更容易受到病原微生物感染，其中細菌是最為嚴重的感染性病原。目前對綠海龜細菌性病原的分離、致病力與耐藥性研究較少，影響了綠海龜繁育與保護的進一步發展。
本研究針對廣東惠東海龜國家級自然保護區患病綠海龜(稚龜)疑似病原菌分離鑒定與抗生素耐藥性分析，并對部分分離菌株進行致病力評價，為綠海龜細菌病防控及其綠海龜保護和救護提供了臨床數據。
1.1 樣品來源
采樣綠海龜(稚龜，體重30～100 g)均來自廣東省惠東海龜國家級自然保護區。患病龜多表現為鼻腔、口腔潰瘍，頸部皮膚、鰭狀肢皮膚潰爛，皮膚結節，背甲潰爛，部分病龜眼部分泌物增多、流膿。
1.2 試驗材料
血瓊脂平板、TCBS(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar)培養基、MH(Mueller-Hinton)培養基、LB(Luria-Bertani)肉湯培養基及細菌生化鑒定管購自廣東環凱微生物科技有限公司；
細菌DNA提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；
ExTaqMix和pMD18-T載體購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；
大腸桿菌DH5α感受態購自北京擎科生物科技有限公司；
藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。
1.3 細菌分離純化
2019—2021年，對100余只患病龜潰瘍鼻腔、潰瘍或潰爛口腔、潰瘍或紅腫泄殖腔、潰爛表皮、皮膚結節等病灶進行細菌分離純化。用無菌剪刀剪開鼻黏膜、口腔黏膜、泄殖腔黏膜、眼黏膜潰瘍表皮，無菌拭子蘸取病變部位膿液，分別在血平板和TCBS平板上劃線；
對于潰爛表皮、皮膚結節等處，先用75%乙醇擦拭表面，再用無菌解剖剪在病灶上剪開缺口，將無菌接種環深入其中，劃線于血平板與TCBS平板上。病龜取樣后創面用75%乙醇消毒隔離飼養。所有平板均于培養箱中30 ℃倒置培養24 h，挑取形態一致的優勢單菌落進行革蘭氏染色，并將優勢單菌落接種至LB培養基，30 ℃擴大培養24 h。
1.4 菌種鑒定
1.4.1 細菌16S rRNA序列PCR擴增
取5 mL擴大培養的菌液，按照天隆細菌DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA作為PCR擴增模板。細菌通用16S rRNA基因引物(16S-27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；
16S-1541R：5′-AAGGAGGTGA-TCCAGCCGCA-3′)[19]送北京擎科生物科技有限公司合成，作為PCR擴增引物。PCR擴增體系：2×TaqMix 25 μL，16S-27F引物(10 μmol/L)1 μL，16S-1541R引物(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補足至50 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；
94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；
72 ℃再延伸8 min。隨后，PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)分析擴增片段是否符合預期。
1.4.2 16S rRNA T克隆載體的構建與測序
確定擴增片段符合預期后，切膠純化回收目的片段，取4 μL目的片段，加入1 μL pMD18-T載體，5 μL Solution Ⅰ，混合均勻，16 ℃作用2 h，取8 μL連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布Amp+LB固體培養基，37 ℃倒置培養過夜，隨后挑取單克隆，利用16S rRNA引物進行PCR鑒定，陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測序，BLAST比對。同源性≥99.0%，可以定義到種；
同源性97.0%～98.9%，可以定義到屬水平。
1.4.3 弧菌細菌生化鑒定
挑取16S rRNA鑒定成功的弧菌單菌落至無菌生理鹽水中，制備成0.5麥氏濁度標準管濃度(約1.5×108cfu/mL)，按照使用說明書接種到細菌生化鑒定管中，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[20]及廣東環凱微生物科技有限公司弧菌生化鑒定盒判定標準，對分離菌株生化鑒定。
1.5 分離菌株毒力分析
試驗用中華草龜(Chinemysreevesii)，體重(90±10)g，購自廣州市某草龜養殖場。隨機采集5只試驗龜，用無菌拭子分別刮取鼻腔、口腔和泄殖腔黏膜，劃線于血平板和TCBS平板上，30 ℃倒置培養24 h，鑒定全部分離菌株，確保試驗龜不攜帶溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。隨機分為36組，每組10只，在40 cm×40 cm×30 cm玻璃缸暫養2周，每天飼喂2次，換水1次。取擴大培養的7株溶藻弧菌，接種TCBS液體培養基，30 ℃培養24 h后，10倍梯度稀釋5個梯度，取100 μL涂布TCBS固體培養基，30 ℃培養24 h后計數。7株菌液均調整至109、108、107、106、105cfu/mL，各濃度以0.5 mL劑量后腳窩部位腹腔注射攻毒，每天觀察攻毒龜發病癥狀，記錄死亡率。
1.6 藥敏試驗
參照紙片擴散法(K-B法)進行抗生素藥敏試驗，檢測分離菌株對氟苯尼考、恩諾沙星、多西環素、新霉素和復方新諾明的耐藥性。步驟：取200 μL 0.5麥氏濁度(約1.5×108cfu/mL)劑量的菌懸液均勻涂布于含0.1% NaCl的MH瓊脂平板，每個平板均勻粘貼6個藥敏紙片，于30 ℃培養箱倒置培養12 h，測量并記錄抑菌圈直徑，依據中華人民共和國衛生部醫政司WS/T 125—1999紙片法抗菌藥物敏感試驗標準判斷分離菌株的藥物敏感性。
1.7 統計學分析
分離菌株LD50測定采用SPSS概率單位加權回歸法檢驗。2019—2020年分離菌株耐藥率與2021年分離菌株差異分析采用SPSS交叉表卡方檢驗，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。
2.1 細菌分離鑒定
2019—2021年，從100余只患病龜病變部位劃線接種，分別挑取血瓊脂平板具有溶血活性的優勢單菌落、TCBS平板上優勢單菌落，進行革蘭氏染色，結果顯示均為革蘭氏陰性菌。挑取優勢單菌落接種至液體培養基，擴大培養，共分離得到疑似病原菌45株。以疑似病原菌提取DNA為模板，進行16S rRNA序列擴增，結果均擴增得到1 515 bp的目的片段(圖1)。
圖1 分離菌株16S rRNA鑒定結果Fig.1 16S rRNA identification result of isolated strains 注：M.DL2000 DNA Marker；
1～45.分離菌株；
-.空白對照 Note：M，DL2000 DNA Marker.1-45，Isolated strain.-，Blank control
切膠回收目的片段，連接pMD18-T載體，經PCR鑒定后，重組質粒送測序公司測序。測序結果與GenBank數據庫細菌16S rRNA基因序列同源性均在99.0%以上，可以確定為同一種。因此根據16S rRNA鑒定結果，從綠海龜體表潰瘍表皮、皮膚結節、口腔拭子、泄殖腔拭子、鼻拭子和眼拭子共分離鑒定了綠海龜疑似病原菌45株，涉及10個菌屬，其中占比最高的是弧菌屬(Vibrio)細菌，共19株，占42.22%，分別為溶藻弧菌7株，哈維氏弧菌(V.harveyi)4株，副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)1株，弗尼斯弧菌(V.furnissii)2株，溶珊瑚弧菌(V.coralliilyticus)1株，河流弧菌(V.fluvialis)1株，錫那羅州弧菌(V.sinaloensis)1株，塔式弧菌(V.tubiashii)1株，東方弧菌(V.orientalis)1株；
乳球菌屬(Lactococcus)細菌7株，占15.56%，其中乳酸乳球菌(L.lactis)5株，格氏乳球菌(L.garvieae)2株；
其他菌株占比少(表1)。
表1 綠海龜分離疑似病原菌匯總
續表1
2.2 分離弧菌生化鑒定結果
根據19株分離弧菌的16S rRNA鑒定結果選取生化鑒定管進一步生化鑒定(表2)。按照《常見細菌系統鑒定手冊》以及廣東環凱微生物科技有限公司弧菌科(Vibrionaceae)細菌生化鑒定盒判定標準，生化鑒定結果與16S rRNA鑒定結果一致。
2.3 分離菌株毒力分析
溶藻弧菌CMT90807、CMC21032031、CMC21032032、CMC21032131、CMC2103216、CMLU908162、CMC2103-2081株均以109、108、107、106、105cfu/mL、0.5 mL劑量腹腔注射中華草龜，每天記錄死亡率。除CMC21032031株處理在第4天出現死亡外，其他6株處理均在第2天就出現死亡，7株弧菌109cfu/mL劑量處理死亡率均達到100%(表3)，據SPSS軟件概率單位加權回歸法分析，CMT90807、CMC21032031、CMC21-032032、CMC21032131、CMC2103216、CMLU908162、CMC21032081株LD50分別為7.40×107、2.59×108、6.35×106、7.22×107、7.22×107、2.99×106、7.22×106cfu/mL。發病龜為鰭狀肢皮膚潰爛，背甲潰爛，剖解死亡龜，均肝臟充血壞死；
腸道出血，腸腔充滿炎性膿液；
脾臟腫脹壞死(圖2)。對病變組織制作石蠟切片，腸道表現為腸絨毛增粗，結構紊亂，損傷脫落，基底層腫脹，炎性細胞浸潤；
肝臟有廣泛團狀出血灶，肝細胞腫大；
脾臟有明顯的壞死灶，淋巴鞘結構損壞(圖3)。在腸道、肝臟和脾臟均能重新分離并鑒定到溶藻弧菌優勢菌落。
表3 分離菌株攻毒后中華草龜死亡率
圖2 攻毒后死亡中華草龜剖解結果Fig.2 Anatomical symptoms of dead Chinemys reevesii post infection
2.4 細菌耐藥性
2019—2021年，在患病的綠海龜病變組織、器官中分離并鑒定45株疑似病原菌，用K-B藥敏紙片法檢測了分離的疑似病原菌對氟苯尼考、恩諾沙星、復方新諾明、鹽酸多西環素、硫酸新霉素和環丙沙星的耐藥性。45株菌株對鹽酸多西環素和復方新諾明2種抗生素的耐藥性較高，耐藥率分別為55.56%和53.33%。對硫酸新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和環丙沙星耐藥性較低，耐藥率分別為37.78%、31.11%、28.89%和15.56%(圖4)，結果表明，分離菌株對水產養殖允許使用的抗生素產生了不同的耐藥性。
圖4 45株分離菌株耐藥性Fig.4 Antibiotic resistance of 45 isolated strains 注：R.耐藥；
I.中度敏感；
S.敏感；
A.氟苯尼考；
B.恩諾沙星；
C.復方新諾明；
D.鹽酸多西環素；
E.硫酸新霉素；
F.環丙沙星。環丙沙星指維生素C磷酸酯鎂鹽酸環丙沙星預混劑，其他抗生素均指水產用抗生素粉劑。下同 Note：R，Resistance.I，Intermediate.S，Sensitive.A，Florfenicol.B.Enrofloxacin.C，Compound sulfamethoxazole.D，Doxycycline.E，Neomycin sulfate.F，Ciprofloxacin.Ciprofloxacin refers to magnesium ascorbic acid phosphate and ciprofloxacin hydrochloride premix, other antibiotics refer to aquatic antibiotic powders. The same as below
2.5 2019—2020年與2021年分離菌株耐藥率差異
通過對2019—2020年與2021年分離菌株耐藥率對比分析可見(表4)，2019—2020年，分離的21株菌對氟苯尼考、恩諾沙星、復方新諾明、鹽酸多西環素、硫酸新霉素和環丙沙星的耐藥率分別為47.62%、38.10%、61.90%、57.14%、76.19%、23.81%。2021年，分離的24株菌，對氟苯尼考、恩諾沙星、復方新諾明、鹽酸多西環素、硫酸新霉素和環丙沙星的耐藥率分別為16.67%、20.83%、45.83%、54.17%、4.17%、8.33%。經卡方檢驗分析，除鹽酸多西環素外，2021年分離菌株對氟苯尼考、恩諾沙星、復方新諾明、硫酸新霉素、環丙沙星耐藥率較2020年有極顯著性降低(P<0.01)。
表4 2019—2020年與2021年分離菌株耐藥率
生態意識、環保意識的逐漸增強推動了中國(大陸)的綠海龜保護研究，廣東惠東海龜國家級自然保護區是目前亞洲大陸唯一的海龜保護區，中國的綠海龜保護成為全球綠海龜保護的重要組成部分。2017年廣東惠東海龜國家級自然保護區成功實現了綠海龜人工繁殖，為綠海龜的保護提供了堅實的基礎，伴隨著稚龜的種群密度不斷增加，細菌性病害成為人工種群稚龜發病死亡的首要因素[21-22]，但是長期以來，均未有南海海域綠海龜細菌性疾病流行病學調查的報道，極不利于我國綠海龜的保護。
本研究對惠東縣海龜國家級自然保護區進行了為期3年的細菌性疾病流行病學調查，共分離到疑似病原菌45株，其中弧菌屬細菌19株，屬絕對優勢，占42.22%。弧菌屬細菌多為重要的水產養殖動物病原菌，可感染多種魚類、蝦類和貝類，均能導致海洋生物高死亡率[1，22-26]。本研究從綠海龜口腔拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子以及表皮潰瘍組織中均分離到溶藻弧菌優勢菌落。墨西哥海域的綠海龜中分離了82株細菌，62株為弧菌屬細菌，其中39株為溶藻弧菌，17株為副溶血弧菌[22]。臺灣海域的綠海龜分離了47株革蘭氏陰性細菌，其中15株為弧菌屬細菌[1]，證明弧菌是綠海龜最為主要的流行致病菌株。
綠海龜的病原菌很多為環境常在條件致病菌[22]，目前研究報道的細菌均未進行回歸試驗，對其毒力評價確定其致病力在綠海龜病害防控中尤為迫切。為此，本研究對分離到的溶藻弧菌開展了中華草龜毒力試驗，試驗結果表明，7株溶藻弧菌均能造成中華草龜死亡，LD50分別為7.40×107、2.59×108、6.35×106、7.22×107、7.22×107、2.99×106、7.22×106cfu/mL，并且在死亡病龜中均能重新分離到菌株，7株溶藻弧菌對中華草龜具有明顯的毒力。以中華草龜為攻毒模型，也可以為評價綠海龜細菌性病原的毒力以及防控研究提供數據支撐。
細菌的耐藥性分析對抗菌藥物選擇至關重要，是科學用藥的基礎。本研究對45株分離菌株進行了抗生素敏感試驗，分離菌株對6種水產養殖允許使用的抗生素具有不同程度的耐藥性。抗生素是典型海洋污染物之一，耐藥菌更是容易在海洋動植物中定植、生存和繁殖。綠海龜作為一種洄游性生物，攜帶細菌抗生素耐藥分析也成為評價海洋抗生素污染水平的指標[4，26-31]。本研究顯示，我國惠東綠海龜自然保護區綠海龜(稚龜)攜帶疑似病原菌耐藥性普遍存在。值得注意的是，2021年分離菌株耐藥率相比2019—2020年有明顯地降低，這可能與本課題組從2019年開始根據藥敏試驗結果指導綠海龜病害防控過程中的抗生素使用有關，有效降低了綠海龜攜帶病原的耐藥率，進一步保護了綠海龜保護區的生物安全與生態安全。
本研究對綠海龜(稚龜)病原菌分離鑒定以及抗生素耐藥性分析，將有效提升綠海龜的全人工繁育水平，為海龜自然保護區提供生物安全保障，對體現中國在綠海龜保護領域的國際影響力、促進海洋生態保護具有重要的意義。
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