白亮, 王寶太, 高志峰, 蔣安, 梁金強
(西安交通大學第二附屬醫院普外科,陜西省西安市710004)
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為臨床常見惡性腫瘤，主要采用肝切除術和原位肝移植治療方案，HCC極易發生轉移和復發，遠期預后并不理想。因此，探討基于分子網絡靶點抑制腫瘤細胞增殖、遷移是解決肝癌術后復發的關鍵。研究發現，miRNA通過與mRNA的3′-非編碼區(3′-untranslated region，3′-UTR)結合，可靶向調控蛋白表達和功能，miRNA與腫瘤的發生、轉移、復發密切相關[1]。miR-580表達與乳腺癌細胞和骨肉瘤細胞的生長密切相關，其表達水平提高能明顯抑制兩種腫瘤細胞的生長，并且降低晚期腫瘤的臨床分級[2]。miRNA可充當HCC致癌基因或腫瘤抑制基因，調控肝癌發生的始動因素或者下游靶點,例如miRNA-342-3p、miRNA-15a-3p、miRNA-140[3-4]，提示miRNA能夠作為肝癌防治的靶點，但miR-580尤其是miR-580-3p對肝癌細胞增殖、凋亡等的作用尚不完全明確，因此，本文對此進行了研究。
1.1 主要儀器和試劑
TRIzol試劑購自廣州捷華生物科技有限公司；
cDNA合成試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；
TaqMan MicroRNA Assay購自北京斯科科技有限公司；
TaqMan? Universal PCR Master Mix購自昆明皇寶商貿有限公司；
BCA試劑盒購自青島科創天地生物科技有限公司；
Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自Biovision公司；
HEK-293T細胞購自上海朝瑞生物科技有限公司；
轉染試劑購自廣州一科生物科技有限公司；
siRNA(COL11A1)、COL11A1過表達質粒、miR-580-3p inhibitor和miR-580-3p mimics均由北京擎科設計和合成。CCK-8試劑盒購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。
1.2 組織和細胞
納入2019年6月—2021年6月本院42例HCC手術患者的肝癌組織及癌旁組織。所有患者術前均未接受放療或化療，均自愿參與本研究。本研究獲得了本院倫理委員會批準。人正常肝細胞LO2、QSG-7701和人肝癌細胞系HepG2、Huh-7、Li-7、SK-Hep-1細胞系均購自普諾賽公司，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基5%CO2、37 ℃培養至生長期。分別將siCOL11A1(COL11A1敲低組)、COL11A1過表達質粒(COL11A1過表達組)、miR-580-3p inhibitor(miR-580-3p敲低組)和miR-580-3p mimics(miR-580-3p過表達組)與轉染試劑混合后加入人肝癌細胞系培養板孔中，轉染12 h后更換為正常培養基培養。
1.3 qRT-PCR檢測miR-580-3p和COL11A1 mRNA表達
采用TRIzol提取總RNA，反轉錄為cDNA。RT-PCR條件：95 ℃ 2 min；
95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s共45個循環。采用U6和GAPDH為內參基因，用相對定量法計算基因表達量。引物序列GAPDH-F:5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，R:5′-AC ACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′；
U6-F:5′-GAGGGCC TATTTCCCATGATT-3′，R:5′-TAATTAGAATTAATTT GACT-3′；
COL11A1-F:5′-ACCCTCGCATTGACCTTC C-3′，R:5′-TTTGTGCAAAATCCCGTTGTTT-3′；
miR-580-3p-F:5′-GACTATCGGGACATGTTA-3′，R:5′-GC AGGGTCCGAGGTATTC-3′。
1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期
轉染48 h后，收集各組貼壁細胞。用PBS洗滌細胞3次，將Annexin-V-FITC、PI和HEPES緩沖液按比例配制成Annexin-V-FITC/PI染料溶液(1∶2∶50)用于凋亡細胞的染色，用HEPES緩沖液清洗后，流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期。將人肝癌細胞系HepG2、Huh-7、Li-7、SK-Hep-1消化并固定在冰冷75%乙醇中，4 ℃過夜，碘化丙啶室溫下黑暗中孵育30 min，流式細胞術檢測細胞周期。實驗重復3次。
1.5 免疫印跡法檢測COL11A1、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K蛋白
提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白水平。30 μg總蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，80 V恒壓35 min，120 V 45 min。將凝膠蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。COL11A1、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K、GAPDH抗體稀釋后加入膜上，4 ℃孵育過夜。PBST緩沖液(含0.1%Tween-20 PBS緩沖液)洗膜3次，用HRP標記的二抗室溫孵育1 h。采用化學發光法顯色條帶，定量灰度值。
1.6 CCK8法檢測細胞增殖
CCK8法檢測細胞增殖水平(細胞活力)。相應處理后，將人肝癌細胞系HepG2、Huh-7、Li-7、SK-Hep-1接種在96孔板培養1、2、3天。然后加入CCK-8試劑，孵育2 h后通過酶標儀測定450 nm處光密度(OD)，計算細胞活力。細胞活力=實驗組或對照組450 nm處OD-空白孔450 nm處OD。
1.7 熒光素酶報告實驗
COL11A1 3′UTR區域的序列從肝癌細胞系HepG2的cDNA中進行擴增。將PCR產物克隆到熒光素酶pmirGLO載體中，構建野生型COL11A1-3′UTR-WT和突變型COL11A1-3′UTR-MT載體。然后將熒光素酶報告載體與每個質粒共轉染到HEK-293T細胞中，以海腎熒光素酶表達載體pRL-TK為內參。使用Promega的Digital-Luciferase Reporter Assay System檢查雙熒光素酶活性。
1.8 統計學分析
采用SPSS 21.0軟件進行統計學處理。兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，采用Spearman相關性分析，P<0.05為差異具有統計學意義。
2.1 各組miR-580-3p和COL11A1 mRNA表達的比較
與癌旁組織比較，肝癌組織COL11A1 mRNA表達升高、miR-580-3p表達降低；
與人正常肝細胞系比較，人肝癌細胞系miR-580-3p表達降低、COL11A1 mRNA表達升高(P<0.05；
圖1)。Spearman相關性分析發現，肝癌組織中COL11A1 mRNA表達與miR-580-3p表達呈負相關(r=-0.429，P<0.05)。
圖1 肝癌組織與癌旁組織、人肝癌細胞系與人正常肝細胞COL11A1和miR-580-3p表達的比較
2.2 過表達或敲低miR-580-3p后肝癌細胞增殖、凋亡、細胞周期的比較
與對照組比較，人肝癌細胞系增殖水平過表達miR-580-3p后降低，敲低miR-580-3p后升高(P<0.05)；
人肝癌細胞系凋亡率過表達miR-580-3p后升高，敲低miR-580-3p后降低(P<0.05)；
敲低miR-580-3p能夠誘導人肝癌細胞在G1/S細胞周期停滯(P<0.05；
圖2)。
圖2 過表達或敲低miR-580-3p后肝癌細胞增殖、凋亡、細胞周期的比較
2.3 miR-580-3p通過靶向抑制COL11A1調控肝癌細胞凋亡
通過miRBase數據庫在線分析發現，miR-580-3p具有多個潛在靶基因，敲低COL11A1時HepG2細胞凋亡率上升(P<0.05，圖3)。人肝癌細胞系凋亡率過表達COL11A1后降低，敲低COL11A1后上升；
人肝癌細胞COL11A1 mRNA水平過表達miR-580-3p后降低，敲低miR-580-3p后升高(P<0.05；
圖3)。
圖3 miR-580-3p通過靶向抑制COL11A1調控肝癌細胞的凋亡
2.4 Akt和PI3K參與miR-580-3p/COL11A1介導的生物學效應
肝癌細胞中p-Akt、p-PI3K水平在COL11A1過表達和miR-580-3p敲低后顯著升高，而總Akt、PI3K表達保持不變；
肝癌細胞中p-Akt、p-PI3K水平在COL11A1敲低或miR-580-3p過表達后降低，而總Akt、PI3K水平不變(圖4)。
圖4 Akt和PI3K 參與miR-580-3p/COL11A1介導的生物學效應
HCC是第五大侵襲性癌癥，已成為全球癌癥相關死亡的第三大原因[5]，但只有少數早期確診的病例能夠通過手術切除或肝移植治愈[6]，大多數患者會因腫瘤復發或遠處轉移而發展為晚期疾病，導致生存率低[7]?；谛》肿泳W絡靶點探索抑制腫瘤發生和轉移可能成為肝癌的防治靶點，因此，本文探究了miR-580-3p和COL11A1在肝癌發生中的作用。
miRNA是一種小的非編碼單鏈RNA[8]，可以在轉錄后水平抑制靶基因表達，在腫瘤發生和轉移中充當腫瘤抑制因子或啟動因子[9]。本研究發現，與癌旁組織比較，肝癌組織中miR-580-3p表達下調。與人正常肝細胞系比較，人肝癌細胞系miR-580-3p表達下調，提示miR-580-3p可能在肝癌的發生中發揮重要作用。隨后，本研究發現過表達miR-580-3p后，人肝癌細胞系增殖降低，凋亡率升高。相反，miR-580-3p敲低后，人肝癌細胞增殖升高，凋亡率降低，細胞周期停滯在G1/S期。因此，本研究發現miR-580-3p可以調控細胞周期參與肝癌細胞增殖和凋亡，提示肝癌細胞中miR-580-3p水平降低是肝癌發生的一個始動因素。
如上文所述，miR-580-3p水平降低可能是肝癌發生的一個始動因素，那么miR-580-3p是通過下游什么途徑發揮作用的呢？既往研究指出，COL11A1是肝癌細胞增殖過程中的一個下游調控分子，肝癌細胞COL11A1表達水平是升高的[10]，這與本文結果類似。那么，COL11A1是否是miR-580-3p的一個調控靶點呢？本研究發現，COL11A1是miR-580-3p的一個調控靶點；
過表達miR-580-3p后，人肝癌細胞系COL11A1 mRNA水平降低；
敲低miR-580-3p后，人肝癌細胞系COL11A1 mRNA水平升高。因此，miR-580-3p可以靶向調控COL11A1的表達。進一步研究發現，過表達COL11A1后人肝癌細胞凋亡率降低；
相反，敲低COL11A1后人肝癌細胞凋亡率上升。以上結果提示，miR-580-3p可以通過COL11A1的表達發揮抗肝癌細胞增殖和促進肝癌細胞凋亡作用。
有研究已發現，COL11A1與多種實體瘤(包括肺癌)中的癌癥遷移有關[11]，且有望成為有效的非小細胞肺癌診斷標志物[12-13]，然而在肝癌中尚無COL11A1相關研究。本研究發現敲低COL11A1能夠抑制肝癌細胞凋亡，并且miR-580-3p的抗腫瘤功能能夠通過COL11A1介導。那么，COL11A1和miR-580-3p的表達水平變化能否反映肝癌的進程還需要進一步探究。
除了miR-580-3p和COL11A1在肝癌細胞中的生物學作用外，本研究還評估了其潛在的作用機制。據報道，PI3K/Akt是COL11A1的下游介質，而Akt抑制劑具有逆轉卵巢癌細胞中的順鉑耐藥性的功能[14-15]。與既往研究一致，本研究發現，在肝癌細胞中敲低COL11A1或過表達miR-580-3p后，p-Akt和p-PI3K的表達均顯著降低。據此推測，miR-580-3p和COL11A1可能是HCC的潛在治療靶點。
綜上所述，肝癌細胞和肝癌組織中miR-580-3p的表達水平降低，miR-580-3p/COL11A1軸可能通過調控PI3K/Akt通路影響肝癌細胞的凋亡。
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