阿曼古麗·如則， 王雪梅， 尼魯帕爾·謝甫開提， 趙 翎， 趙幫豪， 霍 強， 高曉明
(1省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室；
2**醫學動物模型研究重點實驗室， 烏魯木齊 830054；
3西安醫學院公共衛生學院衛生學教研室， 西安 710021；
4**醫科大學第一附屬醫院心臟中心， 烏魯木齊 830054)
心血管疾病是嚴重威脅人類健康的主要疾病，我國心血管疾病導致的死亡居城鄉居民總死亡原因的首位[1]。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是冠心病、心力衰竭、房顫等心血管疾病的病理基礎[2]，其早期標志性的病理特征是血管內皮下大量巨噬細胞內脂質的蓄積及泡沫細胞的形成[3-4]。探討巨噬細胞脂質吞噬的分子機制，對于動脈粥樣硬化的早期治療具有重要的意義。長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, LncRNA) 是無明顯的蛋白質編碼功能的非編碼RNA[5]。H19基因位于人類11號染色體上，在RNA聚合酶II的催化作用下可轉錄生成LncRNA H19[6]。LncRNA H19在多種腫瘤疾病[7-11]及代謝性疾病[12-15]發生發展中發揮重要作用。近期研究表明，動脈粥樣硬化患者中，LncRNA H19表達升高，且血漿LncRNA H19水平升高與冠狀動脈疾病風險增加相關[16-18]，提示LncRNA H19可能參與動脈粥樣硬化的發生發展，但其分子機制尚不明確。
過氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPAR-α)是配體激活的轉錄因子，在脂質和葡萄糖代謝相關基因的轉錄調節中發揮重要作用[19-20]。研究證實，LncRNA H19的抑制通過miR-675/PPAR-α軸的調節來減輕缺血再灌注對心肌造成的損傷[21]，但LncRNA H19是否通過抑制PPAR-α活性介導動脈粥樣硬化中的脂質蓄積尚不清楚。本研究在細胞水平，運用RNA干擾技術探討LncRNA H19在THP-1來源巨噬細胞脂質吞噬中的作用以及與脂代謝相關轉錄因子PPAR-α之間的關系。
1.1 材料人外周血單核細胞系(THP-1)購自中國科學院細胞庫，胎牛血清、RPMI-1640培養基、Opti-MEM培養基、青鏈霉素、PBS購自Gibco公司，siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，Lipo-fectamineTM3000轉染試劑、TRIzol總RNA抽提試劑購自Invitrogen公司，佛波酯(PMA)，油紅O染料購自Sigma-Aldrich?公司，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)購自廣州奕元生物技術有限公司，高效RIPA裂解液購自索萊寶公司，FastKing一步法RT-PCR試劑盒購自天根生化科技公司、SYBR Green熒光定量試劑盒購自QIAGEN公司，PPAR-α抗體、β-actin 抗體均購自Cell Signaling Technology公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及泡沫細胞模型的建立 將THP-1細胞置于含15%胎牛血清以及1%青-鏈霉素的RPMI1640細胞培養基中，在37℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中進行培養。1～2天換液，待細胞融合度達到80%～90%時進行傳代。取生長狀態良好的細胞按5×105個/孔接種于6孔培養板上。用200 nmol/L的PMA處理THP-1細胞24 h，誘導其分化為巨噬細胞。使用LipofectamineTM3000轉染試劑，分別將H19小干擾RNA(siRNA)(5′-CCCGUCCCUUCUGAAUUUATT UAAAUUCAGAAGGGACGGGTT-3′)和陰性對照組siRNA(5′-ACAGAACAUAACGACGAACTTGU-UCGUCGUUA UGUUCUGUTT-3′)轉染至THP-1源性巨噬細胞中，轉染6 h后換培養基，用含50 μg/mL ox-LDL的培養基培養48 h，使其吞噬脂質形成巨噬細胞源性泡沫細胞。
1.2.2 油紅O染色及脂質含量測定 ox-LDL刺激48 h后，吸去上清液。PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min(37℃)。去除固定液，用蒸餾水清洗3遍，油紅O染色液染色15 min(37℃)；
蒸餾水洗3遍，顯微鏡下觀察并拍照。此后，去除蒸餾水加入異丙醇，37℃孵育箱中放置5 min，抽提油紅O。吸取每孔中的液體加入至96孔板中，酶標儀測定560 nm波長的OD值。
1.2.3 實時熒光定量PCR(real-time qPCR) 實驗結束后，用TRIzol試劑提取細胞總RNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定RNA濃度及純度，并取1 μg RNA進行逆轉錄和實時熒光定量PCR。H19引物：上游序列5′-CTTTCATGTTGTGGGTTCTGG-3′，下游序列5′-CGGGTCTGTTTCTTTACTTCC-3′，內參18S引物：上游序列5′CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，下游序列5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3′。反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，循環40次。樣本均設置3個復孔，以18S為內參，用2-ΔΔCT的方法來計算LncRNA H19的相對表達量。
1.2.4 Western blot檢測 用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行定量，100℃加熱使蛋白變性。取20 μg蛋白提取液，室溫下行SDS-PAGE電泳。用濕轉法將蛋白電轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉。加入相應的一抗(均1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜。0.1%TBST洗膜3次，每次5 min。加入堿性磷酸酶標記的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫避光孵育2 h，洗膜后顯色。用Image Lab圖像分析系統對Western印跡圖片進行定量分析，以目的蛋白與內參照蛋白GAPDH條帶的灰度比值表示。
2.1 THP-1來源泡沫細胞中LncRNA H19表達升高正常的THP-1為懸浮生長細胞，形態呈圓形，折光度良好，無顆粒。經200 nmol/L的PMA處理24 h后，由懸浮式生長變成貼壁生長，由圓形變成不規則形態，體積進一步增大，代表細胞已分化為巨噬細胞(圖1)。經50 μg/mL 的ox-LDL處理48 h后，油紅O染色，顯微鏡下觀察，發現細胞質內出現大量的紅色脂滴顆粒(圖2B)，符合泡沫細胞形態特點，表明泡沫細胞模型建立成功。
與對照組相比，ox-LDL處理組脂滴含量明顯增加(圖2A，B)，異丙醇抽提定量結果顯示，脂質含量增加1.25倍(圖2C，P<0.01)。qPCR檢測結果顯示，ox-LDL處理后泡沫細胞中的LncRNA H19 mRNA表達量比對照組升高1倍(圖2D，P<0.01)。
2.2 LncRNA H19的基因沉默減輕THP-1來源泡沫細胞的脂質吞噬為了進一步明確LncRNA H19在THP-1來源巨噬細胞脂質吞噬中的作用，分別用陰性對照H19 scramble和H19 siRNA轉染THP-1源巨噬細胞48 h，qPCR檢測轉染效率。結果顯示，H19 siRNA組LncRNA H19基因表達比陰性對照組降低了83%(P<0.01，圖3A)。油紅O染色及異丙醇定量結果顯示，與陰性對照組相比，H19 siRNA組脂質含量減少了28%(P<0.01，圖3B，C)，說明LncRNA H19在THP-1源巨噬細胞脂質吞噬中發揮重要作用。
2.3LncRNAH19的基因沉默抑制PPAR-α的表達 Western blot檢測結果顯示，ox-LDL刺激后，THP-1源巨噬細胞中的PPAR-α蛋白表達水平相比對照組降低了36%，LncRNA H19敲低后，PPAR-α蛋白表達水平恢復到對照組水平(P<0.01，圖4A，B)。提示LncRNA H19可能通過抑制PPAR-α的表達來增加THP-1源巨噬細胞的脂質吞噬。
圖1 THP-1來源泡沫細胞的建立，放大倍數(×50)
圖2 THP-1來源泡沫細胞模型中的脂質含量及LncRNAH19的基因表達變化(×200)
圖3 H19 siRNA轉染后THP-1源巨噬細胞中LncRNA H19基因表達及脂質含量的測定，放大倍數(×200)
圖4 不同處理后THP-1源巨噬細胞中PPAR-α蛋白表達測定
動脈粥樣硬化發生的早期，血管內皮損傷分泌趨化因子和黏附分子，促使外周血中的單核細胞遷移進入內膜下，活化成為巨噬細胞。隨后，在炎癥介質的作用下巨噬細胞表面清道夫受體(Scavenger receptor，SR)的表達增加，使巨噬細胞大量吞噬ox-LDL形成泡沫細胞。泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化發生發展過程中的關鍵起始步驟[3]。因此建立穩定的體外泡沫細胞模型，對研究動脈粥樣硬化的發病機制至關重要[22]。本研究用ox-LDL處理THP-1源巨噬細胞的方法建立體外泡沫細胞模型，并用油紅O染色及異丙醇定量來鑒定模型。結果顯示，ox-LDL處理后細胞質內有大量的紅色脂滴顆粒，脂質含量明顯增加，表明泡沫細胞模型建立成功。
LncRNA參與機體多種生物學及病理生理過程，與人類疾病的發生、發展和防治都有著密切聯系[23]。研究表明，共354個差異表達LncRNA與ApoE-/-小鼠高脂飲食的病理變化密切相關[24]，可能在動脈粥樣硬化的炎癥和代謝過程中發揮作用，提示LncRNA是參與動脈粥樣硬化形成和發展的重要因素，但其在動脈粥樣硬化中的功能和機制尚不清楚。近期研究報道，LncRNA H19在冠心病等多種動脈粥樣硬化性疾病中發揮重要作用[12, 16, 25]，但其在動脈粥樣硬化發展進程中發揮的具體作用及相關的分子機制仍未闡明。本研究發現，THP-1源泡沫細胞模型中LncRNA H19表達明顯增加。用小干擾RNA敲低LncRNA H19表達后，THP-1源泡沫細胞模型中脂質含量明顯降低，說明LncRNA H19在THP-1源巨噬細胞脂質吞噬中發揮重要作用。
過氧化物酶體增殖物激活受體包含的三個亞型(PPAR-α、PPAR-β/δ和PPAR-γ)是核受體超家族的成員，作為配體活化的轉錄因子，在葡萄糖和脂質代謝中起著至關重要的作用[20]。PPAR-α為脂質代謝的主要調節因子，調控多個脂代謝相關靶基因的轉錄表達，這些基因包括脂肪酸活化相關激酶酰基輔酶A氧化酶、硫酶，長鏈脂肪酸運輸相關蛋白脂肪酸轉運蛋白(FATP)，脂肪酸氧化過程的限速酶肉堿棕櫚酰轉移酶I(CPT1)和糖脂代謝關鍵酶過氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔激活物1-α(PGC-1α)等[19]，因此PPAR-α可能作為肥胖、動脈粥樣硬化、血脂異常、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等多種類型脂質代謝綜合征的有效治療靶點[26]。為了進一步探索LncRNA H19促進THP-1源巨噬細胞脂質吞噬的調控機制，本研究在不同處理組中檢測了PPAR-α的蛋白表達，結果顯示，THP-1源泡沫細胞模型中，PPAR-α表達水平降低，而在LncRNA H19基因沉默后，PPAR-α表達顯著回升，脂質含量顯著減少。這些結果表明在高脂條件下LncRNA H19可能通過抑制PPAR-α的表達來促進THP-1源巨噬細胞的脂質吞噬。
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