付小玲 郭 哲 許 靜
宮頸癌是一種最為常見的惡性腫瘤，是導致女性惡性腫瘤死亡的主要原因之一。據臨床研究顯示，宮頸癌發生及發展的因素較多且復雜，導致宮頸上皮內瘤變及宮頸癌的危險因素之一是人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，目前已知的與宮頸癌發生存在緊密關系的兩類高危型HPV分別為HPV16和HPV18，在99%宮頸病變中均檢測出HPV16或HPV18[1]。環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號通路是G蛋白偶聯的細胞信號傳導途徑，在多項細胞生理過程中發揮作用[2]。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是cAMP的主要效應分子，可以使多種細胞質與細胞核內蛋白磷酸化[3]。有研究表明cAMP/PKA參與細胞增殖、分化及凋亡過程，與VEGF的表達密切相關。現為了探究cAMP/PKA通路在HPV16/18相關宮頸癌中的表達情況及臨床意義，報告如下。
1.1 一般資料
選取于我院2018年6月至2021年6月收治的86例宮頸癌患者作為研究組，取同期患有婦科其他良性病變行宮頸切除手術患者75例作為對照組。納入標準：①符合《2016年NCCN宮頸癌臨床實踐指南》[4]中的診斷標準；
②均行手術治療；
③臨床資料完整；
④自愿參與本研究。排除標準：①術前行放化療或免疫治療；
②嚴重肝腎功能不全；
③嚴重自身免疫性疾病。研究組患者年齡33～65歲，平均年齡(46.23±12.62)歲。病理類型：鱗癌53例，腺癌33例。臨床分期：ⅠA期9例，ⅠB期15例，ⅡA期27例，ⅡB期18例，Ⅲ期17例。病理結果：高分化18例，中分化32例，低分化36例。對照組患者年齡34～68歲，平均年齡(47.22±11.38)歲。兩組研究對象性別、年齡等資料無統計學差異，具有可比性(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會同意。
1.2 方法
細胞培養及PKA檢測：將研究組患者術后切除的宮頸病變組織進行收集，同時收集對照組患者術后切取的宮頸組織標本于液氮中保存。將宮頸癌HeLa細胞(上海派通生物科技有限公司)置于含有10%胎牛血素和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基(美國Sigma公司)，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養箱中培養。將培養的HeLa細胞鋪于培養皿中，添加500 μmol/L的cAMP/PKA信號激動劑db-cAMP，靜置2 h后檢測PKA活性。
1.3 觀察指標
對兩組研究對象組織標本中的cAMP/PKA通路的表達水平進行比較，其中陽性判定以細胞質內出現棕色顆粒為陽性，分為陰性、陽性。陰性：標本未見陽性細胞；
陽性：標本可見陽性細胞。
對cAMP/PKA陽性組與陰性組標本進行HPV檢測，采用PCR擴增及膜雜交法。根據醫用核酸分子快速雜交法試劑盒的用法，對組織標本進行DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜及顯色結果。
對cAMP/PKA陽性組與陰性組進行免疫組化法檢測血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達水平情況。
采用Spearman相關性分析，對cAMP/PKA通路表達與VEGF表達及宮頸癌HPV16/18感染情況進行相關性分析。
1.4 統計學方法
應用SPSS 20.0進行統計分析。計數資料以“%”表示，采用χ2檢驗進行組間比較，采用Spearman相關分析cAMP/PKA通路表達與VEGF表達水平及宮頸癌HPV16/18感染情況的相關性，記P<0.05為差異具有統計學意義。
2.1 兩組標本中cAMP/PKA通路的表達水平比較
研究組cAMP/PKA的表達水平呈陰性表達有8例(9.30%)，陽性表達78例(90.70%)，cAMP/PKA通路陽性率為90.70%。對照組中其陰性表達為70例(93.33%)，陽性表達為5例(6.67%)。研究組標本中cAMP/PKA通路陽性率明顯高于對照組(P<0.05)。
2.2 cAMP/PKA陽性組與陰性組中HPV16/18感染情況比較
78例cAMP/PKA陽性表達的宮頸病變組織中，感染HPV16 34例(43.59%)，感染HPV18 39例(50.00%)，HPV16/18總陽性率為93.59%。8例cAMP/PKA陰性表達的宮頸病變組織中，感染HPV16 2例(25.00%)，感染HPV18 2例(25.00%)，HPV16/18總陽性率為50.00%。cAMP/PKA通路陽性組中HPV16/18陽性率明顯高于陰性組(P<0.05)。見表1。
表1 cAMP/PKA陽性組與陰性組中HPV16/18感染陽性率比較(例，%)
2.3 cAMP/PKA陽性組與陰性組中血管內皮生長因子的表達情況
cAMP/PKA通路陽性組中，VEGF表達水平呈陰性表達8例(10.26%)，陽性表達70例(89.74%)；
陽性率為89.74%；
在陰性組中VEGF陰性表達5例(62.50%)，陽性表達3例(37.50%)，陽性率為37.50%。cAMP/PKA通路陽性組中VEGF陽性率明顯高于陰性組(P<0.05)。
2.4 Spearman相關性分析
經Spearman相關性分析可知，cAMP/PKA通路與VEGF表達水平呈正相關性(P<0.05)，cAMP/PKA通路表達水平越高，VEGF的表達水平越高。cAMP/PKA通路與宮頸癌HPV16/18感染情況呈正相關性(P<0.05)，cAMP/PKA通路表達水平越高，患者感染HPV16/18的概率越大。見表2。
表2 cAMP/PKA通路與VEGF表達及宮頸癌HPV16/18感染情況相關性分析
宮頸癌以鱗癌為主要病理類型，且呈逐漸年輕化的趨勢，HPV感染是公認的導致宮頸癌的主要因素[5]。HPV是一種DNA病毒，存在于人體各個部位，由于基因型的不同，HPV有100多種分型。經過研究發現，HPV16、18、33等分型更易引起宮頸病變，高危型HPV16/18是目前臨床最為關注的分型[6]。近年來，臨床治療宮頸癌的主要方式有手術、放射及化學治療，但仍不能提高患者的生存率[7]。手術治療宮頸癌是主要的臨床手段，對病灶組織進行切除，減慢病情發展，但宮頸癌早期發病時缺乏典型的臨床癥狀，因此大多患者在確診時已為中、晚期[8]。有研究表明，患者在治療宮頸癌的過程之中存在復發及遠處轉移，其發生的原因主要可能是腫瘤細胞的免疫逃逸，這是腫瘤發生及發展的一個重要機制[9]。在免疫系統中，cAMP/PKA信號通路主要在固有免疫和獲得性免疫相互調節的過程中發揮作用，通過結合不同的胞外和胞內信號分子從而發揮調節功能[10]。cAMP/PKA通路是經典的細胞信號傳導通路，由G蛋白偶聯受體作為介導[11]。當外界信號分子對膜體進行刺激時，細胞內腺苷酸環化酶被激活，從而細胞內的cAMP表達水平上升，cAMP再激活PKA，PKA表達水平升高產生一系列的生物學反應[12]。已有研究證實，cAMP/PKA在基因轉錄、新陳代謝、細胞增殖、凋亡等過程中均有參與。PKA是cAMP的下游分子，其構成是催化亞基和調節亞基，催化亞基可作為多種底物磷酸化的介導，調節亞基存在兩種亞型RⅠ和RⅡ，主要參與細胞增殖及分化的過程[13]。當外界因素刺激細胞內RⅠ型亞基高水平表達，引起細胞無限增殖，最后形成腫瘤[14]。當cAMP/PKA信號通路被激活時，可調控宮頸癌細胞的免疫逃逸，促進宮頸癌的發展，導致宮頸癌細胞侵襲性生長，患者發病致死率升高，因此深入研究宮頸癌的發展及及免疫逃逸機制可有效提高患者的生存率[15]。
腫瘤發生侵襲轉移有兩種重要途徑，一是血管生成，二是上皮間質的轉化，而VEGF是誘導血管生成的重要因子之一，參與腫瘤血管生成及轉移的過程[16]。目前已有研究表明VEGF與cAMP/PKA信號通路的激活也存在密切關系，激活cAMP/PKA信號通路，能夠促進血管內皮細胞分泌VEGF，促進腫瘤新生血管的生成[17]。
在本研究中，通過檢測兩組研究對象cAMP/PKA通路的表達水平，可得研究組cAMP/PKA表達水平陰性表達為8例，對照組為70例；
研究組陽性表達為78例，對照組為5例；
研究組cAMP/PKA通路陽性率為90.70%，對照組為6.67%。研究組cAMP/PKA通路的陽性率明顯高于對照組，說明在宮頸癌組織細胞中，cAMP/PKA信號通路被激活，高于正常組織中的表達水平。對cAMP/PKA通路陽性組和陰性組的HPV16/18感染情況進行比較，發現在cAMP/PKA通路陽性組中，感染HPV16為34例，陰性組為2例；
陽性組中感染HPV18為39例，陰性組為2例。cAMP/PKA通路陽性組中HPV16/18總陽性率為93.59%，陰性組為50%，陽性組感染HPV16/18的幾率明顯大于陰性組。說明宮頸癌細胞中cAMP/PKA通路的表達水平升高，宮頸癌組織細胞的免疫逃逸被調控，患者機體免疫能力下降，所以感染HPV16/18的概率也增大。本研究還比較了cAMP/PKA通路陽性組與陰性組的VEGF表達水平，得到在陽性組中，VEGF陽性表達為70例，陰性組為3例；
VEGF陰性表達陽性組為8例，陰性組為5例。由此可得，cAMP/PKA通路陽性表達可以促進宮頸癌組織中VEGF的表達水平提高。經過Spearman相關性分析，得到cAMP/PKA通路與VEGF表達水平呈正相關，當cAMP/PKA信號通路被激活時，宮頸癌組織中的VEGF表達水平也會升高；
同時cAMP/PKA通路與宮頸癌HPV16/18感染也呈正相關，在宮頸癌組織中cAMP/PKA的表達水平越高，則患者感染HPV16/18的可能性越大。
綜上所述，宮頸癌組織中cAMP/PKA通路表達水平高于正常組織，cAMP/PKA通路的表達與VEGF表達水平及患者感染HPV16/18 呈正相關性，cAMP/PKA通路的表達水平升高，可以促進VEGF的表達，同時患者感染HPV16/18的風險也升高。
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