林仕文，韓 鋒，魏 玉，陳文傳
藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是指因各類化學藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥、天然藥、保健品、膳食補充劑或輔料及其代謝產(chǎn)物所引發(fā)的肝功能異常和肝組織炎性改變，可導致患者發(fā)生急性肝衰竭，甚至需要肝移植或死亡，為全球肝病死亡原因的第5位[1]。國外流行病學資料顯示，DILI年發(fā)病率約為19.1/100000，而我國人口基數(shù)龐大、臨床藥物品種多，人群普遍存在不規(guī)范用藥現(xiàn)象，公眾對藥物安全性問題和DILI認知不足，增加了DILI發(fā)病率，人群年發(fā)病率預估為23.8/100000，遠高于西方國家的報道[2,3]。DILI發(fā)病機制復雜，是多種機制先后或共同作用的結(jié)果，目前尚未充分闡明[4]。炎癥和藥物暴露的相互作用是DILI發(fā)病機制的重要假說之一。外源性炎癥是DILI的易感因素，也是促進患者肝損傷加劇的重要因素。同時，藥物或其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)藥物代謝酶的作用下也可誘發(fā)肝內(nèi)炎癥應答，促進疾病發(fā)生和進展[5]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一種調(diào)節(jié)基因表達關鍵因子，廣泛參與機體炎癥和癌變等病理學過程[6]。在眾多miRNA中，血清miR21和miR-124a水平在調(diào)控炎癥和肝功能方面具有重要的作用。臨床研究顯示，非酒精性脂肪性肝病、慢性乙型肝炎、肝癌等多種肝臟疾病患者血清miR21和miR-124a水平均顯著升高，表明miR21和miR-124a與肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，可作為有效的生物標志物用于指導上述肝臟疾病的診療，但兩者與DILI的關系及對病情判斷的價值還有待闡明[7-9]。本研究采用實時熒光定量PCR法檢測DILI患者血清miR21和miR-124a水平，旨在為臨床診療提供生物學依據(jù)，現(xiàn)報道如下。
1.1 研究對象 2019年3月～2022年3月我院收治的DILI患者87例，男48例，女39例； 1.2 血清miR21和miR-124a檢測 無菌采集外周靜脈血5 ml，抗凝，12000 r/m離心處理10 min，取上清保存至-80℃冰箱待測。使用miRNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取miRNAs，再采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用美國安捷倫MX3000PPCR儀采用實時熒光定量RT-PCR法擴增miR21和miR-124a目標片段，反應體系為20 μl，RT-PCR反應條件：①miR-21：95℃預變性10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)； 1.3 血生化指標檢測 使用日本日立公司生產(chǎn)的7060型全自動生化分析儀檢測肝功能指標； 2.1 兩組肝功能指標比較 DILI發(fā)生后，DILI患者血清ALT、AST、GGT和TBIL峰值水平均顯著高于對照組(P<0.05，表2)。 2.2 兩組miR-21、miR124a mRNA、NF-κB和IL-6水平比較 在DILI發(fā)生后，DILI患者血清miR-21、miR124a mRNA、NF-κB和IL-6水平均顯著高于對照組(P<0.05，表3)。 例數(shù)miR-21miR-124aNF-κB(pg/ml)IL-6(pg/ml)DILI發(fā)生前871.1±0.21.2±0.31069.4±315.83.8±0.9峰值871.4±0.3①2.6±0.4①3615.4±526.4①12.7±1.8①對照組601.0±0.11.1±0.1692.2±144.63.4±0.7 2.3 不同臨床分型DILI患者血清指標比較 肝細胞型、膽汁淤積型和混合型DILI患者血清miR-21和miR124a mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，混合型DILI患者血清NF-κB和IL-6水平顯著高于肝細胞型或膽汁淤積型(P<0.05，表4)。 肝臟是人體藥物代謝的重要器官，也是藥物毒性產(chǎn)物生成的主要場所，因此易產(chǎn)生藥物性損傷。通常，DILI在用藥5～90天內(nèi)發(fā)病，多數(shù)急性患者并無特異性的臨床表現(xiàn)，僅有肝臟生化指標不同程度的升高，部分患者可出現(xiàn)乏力、惡心、嘔吐、食欲減退等癥狀[11]。目前，尚無金標準診斷DILI，仍屬排他性診斷[12]。本組DILI患者血清ALT、AST、GGT、TBIL升高。近年來，臨床仍在積極尋找某些特異性的預測因子，以期能夠盡早發(fā)現(xiàn)DILI，實現(xiàn)早期治療，但結(jié)果并不理想[13]。 DILI發(fā)病機制復雜，主要包括藥物的直接肝毒性和特質(zhì)性肝毒性。藥物的直接肝毒性可引起免疫和炎癥反應等肝損傷機制； miRNA是一組高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，是調(diào)節(jié)基因表達的關鍵因子，其水平具有時空特異性和組織特異性。通過調(diào)控人體三分之一以上的基因，miRNA參與細胞生長和分化的生理過程，可反映正常細胞和組織的基礎生理狀態(tài)。miRNA也參與炎癥、氧化應激、癌變等病理學過程，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[16,17]。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)，miR耐RNA酶降解，在外周血中具有可檢測到的穩(wěn)定水平。血清mRNA可能反映細胞的病理學狀態(tài)，故可將血清miR作為新型生物標志物指導臨床診療[18]。在眾多miRNA中，miR-21是參與細胞增殖、血管生成、炎癥反應、病毒感染等過程的多功能miRNA，可通過多種靶標參與疾病的發(fā)生和發(fā)展，其血清水平在多種腫瘤組織異常升高，在乳腺癌、非小細胞肺癌、肝癌等多種癌癥發(fā)生過程中發(fā)揮著類似于癌基因的作用[19]。miR-124a廣泛表達于神經(jīng)細胞、肝細胞、免疫細胞等組織細胞，對T細胞的增殖、分化和生長具有調(diào)控作用，與細胞內(nèi)炎癥反應密切相關[20]。已有研究指出，miR-124a可通過靶向作用于機體炎癥因子而參與肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展，這一機制也為肝臟疾病的臨床診治提供了新的靶點[21]。因藥物代謝引起的炎癥反應是DILI發(fā)生的重要機制之一，而與多種肝臟疾病發(fā)生有關的miR21和miR-124a均具有炎癥調(diào)節(jié)作用，故檢測兩者的血清變化有一定的臨床意義。 本研究分析DILI患者血清miR21和miR-124a水平變化，結(jié)果顯示它們相對水平的峰值與血清NF-κB和IL-6峰值水平一致，較健康人均顯著升高。miR-21的基因啟動子區(qū)中包含4種核因子kapp-B的反應結(jié)合元件，可能通過NF-κB信號通路參與了DILI發(fā)生的炎癥過程[22]。miR-124a則能夠調(diào)控機體炎癥反應，參與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究指出，MicroRNA-124a可負性調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體α，使其表達降低，同時調(diào)節(jié)IL-6等炎癥因子水平隨miR-124a表達增加而升高，從而加重肝病患者肝衰竭和對糖皮質(zhì)激素的抵抗[23]。本研究進一步分析不同臨床分型DILI患者各檢測指標水平變化，結(jié)果顯示，僅混合型DILI患者血清NF-κB和IL-6水平顯著高于肝細胞型和膽汁淤積型，而miR-21和miR124a mRNA水平并無顯著性差異，提示血清NF-κB和IL-6水平可為不同臨床分型的DILI診治提供一定的參考依據(jù)，而血清miR-21和miR124a mRNA水平的臨床意義仍需要進一步研究。
年齡為25～64歲，平均年齡為(41.9±8.6)歲。DILI診斷符合《藥物性肝損傷診治指南》的標準[10]，DILI發(fā)生時間均為用藥后6個月內(nèi)，引起肝損傷的藥物包括抗結(jié)核藥31例、中草藥26例、抗生素18例、化療藥物8例和其他藥物4例；
DILI肝細胞損傷型67例、膽汁淤積型11例和混合型9例。排除標準：(1)用藥前存在病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病、肝硬化和肝豆狀核變性；
(2)合并惡性腫瘤；
(3)營養(yǎng)不良；
(4)大量飲酒；
(5)有嚴重的心、腦、腎疾病或精神病。另選擇同期60例健康人作為對照組，男37例，女23例；
年齡為28～61歲，平均年齡為(40.6±7.8)歲，不飲酒。按照《藥物性肝損傷診治指南》臨床分型標準和肝損傷分級，肝細胞損傷型：血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)≥3 ULN，且R≥5；
膽汁淤積型：堿性磷酸酶(ALP)≥2 ULN，且R≤2；
混合型：ALT≥3 ULN，ALP≥2 ULN，且2
2級(中度)：血清alt或alp升高，tbil≥34.2 μmol l，或雖無tbil升高但inr≥1.5；
3級(重度)：血清alt或alp升高，tbil≥85.5 μmol l，伴或不伴inr≥1.5；
4級(急性肝衰竭)：血清alt或alp升高，tbil≥171 μmol l或每日上升≥17.1 μmol l，inr≥1.5或pta<40%，可同時出現(xiàn)(1)腹水或肝性腦病；
(2)或與dili相關的其他器官功能衰竭；
5級(致命)：因dili死亡或需接受肝移植方可生存。患者或其家屬均已簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。< p>
②miR-124a：95℃預變性5 min，95℃ 45 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；
72℃ 10 min。引物設計及合成均由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列見表1。以U6 snRNA為內(nèi)參基因，計算目的基因水平相對于內(nèi)參基因U6的比值，以2-△△ct表示miR21和miR-124a相對水平。
采用ELISA法檢測血清核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和白介素-6(interleukin，IL-6，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)水平。
特質(zhì)性肝毒性涉及藥物及其活性代謝產(chǎn)物誘導的肝細胞線粒體受損、免疫應答、炎癥反應、氧化應激等機制[14,15]。