劉 凱, 袁 帥, 孫 峰
缺血性腦血管病是指腦部血管壁病變、血流動力學障礙等引起的腦部血液供應障礙,常會引發腦組織缺血、缺氧、腦組織壞死等短暫或持久的腦損害,進而導致機體神經功能缺損[1]。隨著溶栓治療的不斷發展,血流恢復后的再灌注腦損傷逐漸成為當今研究的熱點[2]。腦缺血再灌注后會釋放大量炎癥信號,引起炎癥因子大量釋放及炎癥細胞聚集,進而加劇腦組織受損,嚴重威脅患者的生命健康[3]。羅哌卡因是臨床常用的局部麻醉藥,具有一定的抗炎作用,可抑制脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應[4],Wang[5]等研究發現羅哌卡因對腦缺血時血管內皮細胞、血腦屏障具有明顯的保護作用,但關于其對腦缺血再灌注的影響報道較少。環磷酸鳥苷-腺苷合成酶(cyclic adenosine-adenosine synthase,cGAS)是核苷酸轉移酶家族成員,主要通過激活膜蛋白干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon gene,STING)通路發揮作用,cGAS/STING通路激活可增加炎癥細胞因子的表達[6],而抑制cGAS/STING通路可減輕缺血缺氧腦病導致的腦組織受損[7],因此本研究在前人研究的基礎上探究羅哌卡因對腦缺血再灌注的保護作用及對cGAS/STING通路的影響,為臨床緩解腦損傷提供新思路。
1.1 動物 成年SD雄性大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號：SCXK(京) 2016-0011,SPF級,約12周齡,體重約420 g。所有大鼠按照標準條件于本院動物房中飼養,自由進食、飲水,12 h晝夜交替,相對濕度約42%,溫度約25 ℃,按時清潔動物房及鼠籠。本研究經動物倫理委員會批準同意。實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。
1.2 主要試劑及儀器 羅哌卡因、尼莫地平(貨號：T0386L、T0343)購于上海陶素生化科技有限公司;HE染色試劑盒(貨號：G1120)購于北京索萊寶科技有限公司;大鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL-1β)、IL-6、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)(貨號：ml002859、ml037361、102828、059387、077384)購于上海酶聯生物科技有限公司;兔源cGAS、STING、β-actin一抗、羊抗兔IgG二抗(貨號：ab252416、ab227704、ab8227、ab150077)購于Abcam;細胞分級試劑盒(貨號：AAT-60005,上海齊源生物科技有限公司);線粒體DNA分離試劑盒(貨號：KA0895,艾美捷科技有限公司);酶標儀(美國Perkin Elmer公司,型號XElx800);凝膠成像儀(Miulab公司,型號：GIS-500)等。
2.1 動物模型制備及分組給藥 大鼠腦缺血再灌注模型的制備參考文獻[8]中的線栓法,將大鼠分為假手術組(8只)和造模組(40只),將大鼠用3%的異氟烷麻醉后呈仰臥位固定,大鼠頸部皮膚常規消毒后行長2 cm的切口,暴露右側頸總動脈及分叉部,將頸內動脈及頸外動脈分離,分別用4.0號線結扎頸外動脈主干,在頸外動脈近心端離分叉3 mm處剪一小口,將尼龍線栓從切口插入頸動脈,慢慢推進,插入約18.5mm(感到阻力)時停止推進,固定尼龍線栓,缺血2 h后將尼龍線栓小心抽出,實現再灌。假手術組僅分離頸動脈,不結扎及再灌處理。大鼠蘇醒后對大鼠進行神經功能缺損評分,評分為1～3分為造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、羅哌卡因低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組,每組8只。給藥劑量參照人體表法計算,大鼠每日給藥劑量為0.31 mg/kg,則設置羅哌卡因低、中、高劑量為0.075 mg/kg、0.15 mg/kg、0.30 mg/kg。陽性對照組腹腔注射5 mg/kg的尼莫地平[9]。假手術組及模型組腹腔注射等量生理鹽水。連續干預7 d。
2.2 各組大鼠神經功能缺損評分 分別在給藥第0天、第3天、第7天對大鼠進行神經功能缺損評分,無神經功能缺損癥狀記為0分;輕微神經功能缺損癥狀、不能完全伸展左側前爪記為1分;中度神經功能缺損癥狀、向一側轉圈記為2分;重度神經功能缺損癥狀、向一側傾倒記為3分;完全不能行走、意識障礙記為4分。
2.3 大鼠腦組織獲取及病理學和腦梗死面積觀察 將大鼠麻醉后處死,用預冷的生理鹽水灌注心臟以清除血液,4%多聚甲醛灌注后剪開腦部皮膚,取出腦組織,3只用于HE染色和腦梗死面積觀察,5只用于腦組織中炎癥因子、氧化應激因子及cGAS/STING通路相關蛋白表達的測定。將大鼠一半腦組織置于10%福爾馬林溶液中固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切成厚約4 μm的切片,采用HE染色試劑盒進行染色后封片、干燥,于顯微鏡下觀察并分析。將冰箱冷凍后的另一半腦組織進行連續切片(2 mm),TTC溶液染色后多聚甲醛固定(紅色為正常組織,白色為梗死組織),Image J軟件計算梗死面積。
2.4 大鼠腦組織中炎癥因子及氧化應激因子水平檢測 取適量大鼠腦組織,制成組織勻漿,離心取上清,根據TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、MDA相關ELISA試劑盒的要求進行相關因子水平的測定。
2.5 大鼠腦組織細胞質線粒體DNA(mtDNA)水平的檢測 將2.4所余腦組織進行勻漿后經細胞分級試劑盒得到細胞質成分,采用線粒體DNA分離試劑盒提取胞質中mtDNA,以其為模板采用qRT-PCR檢測細胞色素C氧化酶1(cytochrome coxidase 1,CO1)表示mtDNA水平,β-actin上引為5’-ACCTTCTACAAT GAGCTGCG-3’;β-actin下引為5’-CTGGATGGCTACGTACATGG-3’mt-CO1上引為5’-GCCCCA GATATAGCATTCCC-3’;mt-CO1下引為5’-GTTCATCCTGTTCCTGCTCC-3’。
2.6 大鼠腦組織cGAS/STING通路相關蛋白表達測定 加入RIPA組織裂解液提取腦組織中總蛋白,離心后取上清,用BCA法測定其中蛋白質含量,進行電泳實驗以分離蛋白,200 mA恒流下轉膜90 min,8%的脫脂奶粉封閉處理,加入稀釋比為1∶500的cGAS、STING、β-actin一抗,4 ℃下孵育過夜,TBST緩沖液沖洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗,室溫環境中孵育2 h,經過顯色定影后觀察并拍照分析。
3.1 各組大鼠神經功能缺損評分 給藥第0天,與假手術組相比,其余各組大鼠神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05);給藥第3天、第7天,與模型組相比,羅哌卡因各劑量組及陽性對照組大鼠神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量依賴效應,與羅哌卡因各劑量組相比,陽性對照組大鼠神經功能缺損評分降低較明顯(P<0.05)(見表1)。
表1 各組大鼠神經功能缺損評分
3.2 各組大鼠腦組織HE染色觀察 假手術組大鼠腦組織形態基本正常,無明顯病變,神經細胞結構正常且排列緊密;與假手術組相比,模型組大鼠腦組織形態病變明顯,神經細胞排列疏松且結構異常,細胞體積明顯增大,細胞核出現偏移及空泡化現象;與模型組相比,羅哌卡因各劑量組大鼠腦組織形態均得到緩解,且呈現一定劑量依賴效應,與羅哌卡因各劑量組相比,陽性對照組大鼠腦組織緩解效果較優(見圖1)。
圖1 各組大鼠腦組織HE染色觀察(×200)
3.3 各組大鼠腦梗死面積比較 與假手術組相比,模型組大鼠腦梗死面積(39.21±2.46) vs (0.00±0.00)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,羅哌卡因各劑量組大鼠腦梗死面積[(31.08±2.13) vs (39.21±2.46)、(23.15±2.28) vs (39.21±2.46)、(16.10±1.84) vs (39.21±2.46)]顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量效應關系;與羅哌卡因各劑量組相比,陽性對照組大鼠腦梗死面積[(10.09±1.12) vs (31.08±2.13)、(10.09±1.12) vs (23.15±2.28)、(10.09±1.12) vs (16.10±1.84)]降低效果較優(P<0.05)(見圖2)。
3.4 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較 與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,羅哌卡因各劑量組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量效應關系;與羅哌卡因各劑量組相比,陽性對照組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低效果較優(P<0.05)(見表2)。
表2 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較
3.5 各組大鼠腦組織胞質mtDNA水平比較 與假手術組相比,模型組大鼠腦組織胞質mtDNA水平[(4.32±0.41) vs (1.00±0.00)]顯著升高(P<0.05);與模型組相比,羅哌卡因各劑量組胞質mtDNA水平[(3.43±0.30) vs (4.32±0.41)、(2.59±0.22) vs (4.32±0.41)、(1.67±0.19) vs (4.32±0.41)]顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量效應關系;與羅哌卡因各劑量組相比,陽性對照組胞質mtDNA水平[(1.05±0.10) vs (3.43±0.30)、(1.05±0.10) vs (2.59±0.22)、(1.05±0.10) vs (1.67±0.19)]降低效果較優(P<0.05)。
3.6 各組大鼠腦組織氧化應激因子水平比較 與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中SOD水平顯著降低(P<0.05),MDA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,羅哌卡因各劑量組大鼠腦組織中SOD水平顯著升高(P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量效應關系;與羅哌卡因各劑量組相比,陽性對照組大鼠腦組織中SOD水平降低效果及MDA水平降低效果較優(P<0.05(見表3)。
表3 各組大鼠腦組織氧化應激因子水平比較
3.7 各組大鼠腦組織cGAS/STING通路相關蛋白表達比較 與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比,羅哌卡因各劑量組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量效應關系;與羅哌卡因各劑量組相比,陽性對照組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達降低效果較優(P<0.05)(見表4、圖3)。
注：A：假手術組;B：模型組：C：羅哌卡因低劑量組;D：羅哌卡因中劑量組;E：羅哌卡因高劑量組;F：陽性對照組
表4 各組大鼠腦組織cGAS/STING通路相關蛋白表達比較
注：A：假手術組;B：模型組：C：羅哌卡因低劑量組;D：羅哌卡因中劑量組;E：羅哌卡因高劑量組;F：陽性對照組
腦缺血是由腦部血流減少或暫停等多種因素導致的腦部血流供應障礙,是一種常見的急性腦血管病,腦缺血的治療主要以增加灌注為主,腦缺血再灌注既可挽救瀕死的細胞,又可釋放炎癥信號加重細胞損傷,進而導致腦組織受損,嚴重影響患者的神經功能[10～13]。因此腦缺血再灌注中炎癥機制的詳細研究對疾病的改善非常重要。
羅哌卡因屬于長效酰胺類麻醉劑,在術后鎮痛、神經阻滯麻醉、蛛網膜下腔阻滯、分娩鎮痛等均有應用,具有作用時間長、清除率高等特點,同時具有一定的抗炎作用[14,15]。研究發現羅哌卡因能降低紅藻氨酸引起的神經元損傷及凋亡,并顯著改善模型大鼠的記憶功能[15]。羅哌卡因可通過控制氧化應激抑制高糖誘導的腦微血管內皮損傷[16]。本研究結果顯示,經過羅哌卡因治療的大鼠神經功能缺損得到緩解,腦組織受損程度顯著降低,腦梗死面積、腦組織中炎癥因子水平降低,腦組織中SOD水平顯著升高,MDA水平顯著降低,但效果不及尼莫地平,表明羅哌卡因對腦缺血再灌注引起的腦組織受損具有一定的保護作用,且其作用可能與抑制炎癥因子及氧化應激反應有關。
cGAS是核苷酸轉移酶家族成員,對DNA具有識別作用,腦損傷引起細胞損傷或應激反應后,可促進釋放mtDNA到細胞質中,被cGAS所捕獲識別,進而通過催化合成STING增加炎性細胞因子的產生并促進細胞凋亡,進而參與炎癥、衰老、癌癥等發生發展,與心血管疾病、神經退行性疾病等多種疾病聯系密切[17]。申明琪[7]等研究發現缺血缺氧性腦病新生大鼠腦缺血后死亡細胞堆積造成DNA代謝受損,引起cGAS/STING通路激活,導致炎癥細胞因子產生,進一步促進腦組織受損,而抑制該通路可減輕腦組織損傷。本研究結果顯示腦缺血再灌注大鼠腦組織胞質mtDNA水平及cGAS、STING蛋白表達顯著升高,經過羅哌卡因治療后的mtDNA水平及cGAS、STING蛋白表達顯著降低,提示腦缺血再灌注可導致大鼠腦組織中cGAS/STING通路的異常激活,而羅哌卡因可能通過部分抑制cGAS/STING通路,減輕炎癥和氧化應激損傷,減少神經元凋亡,對腦缺血再灌注大鼠發揮腦保護作用。
綜上所述,羅哌卡因對腦缺血再灌注大鼠具有一定的腦保護作用,可能與其抑制cGAS/STING通路有關。本研究僅對羅哌卡因對cGAS/STING通路的影響進行了研究,下一步試驗應設置相應的通路抑制劑及激活劑進行對比實驗,因此仍需深入研究。
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