劉晨光，張義華，曾煉，羅輝宇，丁旭東
1 錦州醫科大學湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院研究生聯合培養基地麻醉科，湖北 襄陽 441000；
2 湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院麻醉科；
3 湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院康復科
骨關節炎是由多種原因引起的慢性退行性疾病［1］，其帶來的疼痛和運動障礙影響患者正常生活，最終可導致功能喪失。骨關節炎目前無法根治，治療目的主要是減輕疼痛、恢復基本的關節活動、避免功能喪失［2］。關節腔內注射局麻藥物被廣泛用于骨關節炎及關節手術后鎮痛，有助于功能恢復。羅哌卡因作用時間長、毒性小，是臨床常用的酰胺類局麻藥物［3］。有研究發現，局部麻醉藥物的毒性作用在軟骨細胞中也有表現［4］。羅哌卡因會影響細胞鉀通道和鈣通道，影響線粒體功能，導致細胞損傷。理論上，適度自噬在線粒體功能受損時起到保護作用，但當自噬超過細胞的最大適應能力時，則會引發線粒體功能障礙，最終導致軟骨細胞死亡。自噬還可通過降解鐵蛋白、減少鐵儲存、導致鐵“超載”從而促進鐵死亡，進一步導致細胞死亡。研究認為，羅哌卡因能夠促進神經元細胞發生自噬，但關于羅哌卡因對軟骨細胞自噬和鐵死亡的影響報道較少。2022 年3 月—7 月，本研究觀察了羅哌卡因對人軟骨細胞C28/I2 的損傷誘導作用，并基于自噬和鐵死亡探索相關機制。
1.1 實驗細胞與主要材料 C28/I2 細胞株購于中國科學院上海細胞資源中心。高糖DMEM 培養基和胎牛血清購自Gibco 公司，羅哌卡因購自辰欣藥業公司，CCK-8 試劑盒購自Biosharp 公司，活性氧試劑盒和JC-1 試劑盒購自凱基生物公司，SDS-PAGE試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司。一抗：GAPDH 購自Absin 公司，LC3、p62 購自三鷹公司、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、重組人鐵蛋白重鏈1（FTH1）購自Cellsignal 公司；
HRP 標記的熒光二抗IgG購自杭州碧云天生物公司。酶標儀購自Molecular Devices公司，倒置顯微鏡購自Olympus公司。
1.2 細胞分組及處理 將C28/I2 細胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖培養基中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下培養。適當換液保持細胞良好狀態，待細胞融合達60% ～ 80%時，用胰酶消化細胞，進行傳代。將細胞隨機分對照組、實驗1 組、實驗2 組、實驗3組。實驗1、2、3組分別給予0.25、0.50、1.00 mmol/L的羅哌卡因處理48 h；
對照組不添加藥物。
1.3 細胞活力檢測 將C28/12 細胞接種到96 孔板，3×103/孔，每孔加入100 μL 培養基。待細胞狀態良好、細胞增殖達60% ～ 80%，參照“1.2”分組操作，每組設3個復孔，培養48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8 溶液，37 ℃搖床孵育2 ～ 4 h。用酶標儀測定每個孔的光密度（OD）值，以對照組細胞活力為100%，以沒有細胞且有CCK-8 試劑的空白孔調零，計算各組細胞存活率。細胞存活率=實驗組OD 值/對照組OD值×100%。
1.4 細胞形態觀察 將C28/I2細胞接種于12孔板中，5×105/孔，取對數增殖期的細胞進行實驗，分組處理方式同“1.2”。培養48 h后，顯微鏡下選取多個視野，觀察各組細胞形態并拍照記錄。
1.5 細胞線粒體活性氧（ROS）及線粒體膜電位檢測 將C28/I2細胞接種于24孔板中，5×105/孔，分組處理方式同“1.2”。培養48 h 后，棄掉孔中培養基，用PBS 洗滌2 次。使用ROS 紅色熒光探針二氫乙啶標記細胞DNA中的ROS，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌2 次。熒光顯微鏡下觀察，采集相應的白光圖像，采用Image J 軟件分析ROS 平均熒光強度。采用JC-1法測定線粒體膜電位。按照試劑說明書配置JC-1工作液，每孔加入200 μL 的JC-1 工作液覆蓋細胞，37 ℃孵育20 min，用PBS 洗滌2 次；
多聚甲醛室溫固定，PBS洗滌2次，加入細胞核染料進行核復染，室溫15 min；
熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件分析各組平均熒光強度，表示膜電位大小。
1.6 細胞中自噬相關蛋白及鐵死亡相關蛋白檢測 采用Western blotting法。將C28/I2細胞接種于6 孔板中，5×107/孔，分組處理方式同“1.2”。培養48 h 后，棄掉孔中培養基，用PBS 洗滌2 次，每孔加入蛋白裂解液，在冰上放置15 min，超聲間斷震碎細胞。放入4 ℃離心機，13 000 r/min、離心15 min，收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性，使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。每孔上樣蛋白量25 μg，電泳并轉膜，脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 洗膜后加入稀釋一抗LC3（1∶2 000）、p62（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）、FTH1（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜3 次。加入羊抗鼠熒光二抗IgG（1∶2 000），室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次。ECL顯影，曝光，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值并進行相對定量。
1.7 統計學方法 采用SPSS22.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2.1 各組細胞活力比較 實驗1、2、3組及對照組細胞存活率分別為98% ± 1%、84% ± 3%、22% ± 2%，100% ± 1%。各實驗組細胞存活率低于對照組，且實驗1、2、3組細胞存活率依次下降（P均＜0.05）。
2.2 各組細胞形態變化 對照組細胞呈多邊形、三角形等不規則形態，細胞體積大，具有人軟骨細胞的結構及特征。各實驗組隨著羅哌卡因作用濃度增加，軟骨細胞數量逐漸減少，細胞形態逐漸變得細長，胞質減少，部分細胞呈球狀、皺縮，凋亡、壞死細胞數量增多。見圖1。
圖1 各組細胞形態變化
2.3 各組細胞線粒體ROS 及線粒體膜電位比較對照組及實驗1、2、3組線粒體ROS水平分別為1.00 ± 0.11、1.91 ± 0.18、2.48 ± 0.19、3.51 ± 0.44，線粒體膜 電位 分別 為1.31 ± 0.12、0.84 ± 0.08、0.68 ± 0.06、0.51 ± 0.04。實驗3 組細胞線粒體ROS 水平高于對照組，實驗1、2、3組細胞線粒體ROS水平依次升高（P均＜0.05）。對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組線粒體膜電位依次降低（P均＜0.05）。
2.4 各組細胞自噬相關蛋白及鐵死亡相關蛋白表達比較 對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ依次增加，p62、FTH1、GPX4 蛋白表達依次下降（P均＜0.05）。見表1。
表1 各組細胞自噬相關蛋白及鐵死亡相關蛋白表達比較（± s）
表1 各組細胞自噬相關蛋白及鐵死亡相關蛋白表達比較（± s）
注：與對照組相比，*P＜0.05；
與實驗1組相比，#P＜0.05；
與實驗2組相比，△P＜0.05。
GPX4 0.91 ± 0.12*0.80 ± 0.08*#0.47 ± 0.02*#△1.05 ± 0.10組別實驗1組實驗2組實驗3組對照組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.15 ± 0.25*1.35 ± 0.28*#2.65 ± 0.50*#△0.25 ± 0.05 p62 0.65 ± 0.13*0.47 ± 0.08*#0.18 ± 0.06*#△1.30 ± 0.09 FTH1 0.82 ± 0.04*0.70 ± 0.10*#0.24 ± 0.06*#△0.94 ± 0.07
骨關節炎好發于中老年人。我國人口老齡化趨勢明顯，骨關節炎發病率較高。骨關節炎導致的疼痛、運動障礙、關節畸形、肌肉萎縮等極大降低了患者的生活質量［5］。目前對于骨關節炎的治療主要是減輕疼痛、改善功能、延緩疾病進展。羅哌卡因作為酰胺類局部麻醉藥的代表，被廣泛應用于周圍神經阻滯，用于骨折固定術后鎮痛并減輕局部炎癥反應，還可用于骨關節炎及關節鏡手術后鎮痛。近年來，大量研究表明羅哌卡因可對軟骨細胞產生毒性作用，但機制尚不清楚［6］。SILVA 等［7］研究顯示，羅哌卡因通過降低細胞活力、增加細胞凋亡和引起細胞外基質損傷對軟骨細胞產生毒性作用。本研究發現，羅哌卡因作用于軟骨細胞后，細胞活力降低且作用呈濃度依賴性，軟骨細胞形態也發生變化［8］，隨著羅哌卡因作用濃度增加，軟骨細胞數量逐漸減少，細胞形態變得細長，胞質減少，部分細胞呈球狀、皺縮，凋亡、壞死細胞數量增多，與相關研究結果一致。
JAYARAM 等［9］研究顯示，羅哌卡因的軟骨毒性是由線粒體DNA 損傷導致軟骨細胞凋亡或壞死引起的。線粒體是細胞進行有氧呼吸的部位，通過氧化磷酸化產生ATP，維持機體生存所需能量。細胞在損傷過程中會發生氧化應激，導致ROS 生成增多，線粒體膜電位降低，引發線粒體功能障礙，而受損的線粒體會進一步激活線粒體自噬［10］。自噬可將受損的細胞成分轉運至溶酶體，使其被降解和循環再利用［11］。自噬的特殊類型——線粒體自噬可清除功能失調和受損的線粒體，維持細胞內穩態，保證能量供給［12］。通常情況下，自噬對細胞起到保護作用，然而當自噬激活超過一定范圍時，則可導致細胞損傷，包括加劇損傷進程及降解正常線粒體成分，最終導致細胞死亡［13］。曾煉等［14］的研究指出，羅哌卡因可促進神經元細胞發生自噬，導致神經元細胞凋亡。本研究發現，羅哌卡因作用后，軟骨細胞線粒體ROS生成增加，線粒體膜電位降低，引起線粒體功能障礙；
并且，羅哌卡因可促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，自噬小體增多，自噬底物p62 水平降低，自噬水平增加。
有研究表明，自噬可以促進鐵死亡的發生［15-16］，其機制可能與減少鐵儲存、導致鐵累積有關。鐵蛋白是一種細胞內廣泛存在的儲鐵蛋白，由FTL1 和FTH1 兩個鐵蛋白組件構成。細胞內游離的Fe2+由轉鐵蛋白轉運至鐵蛋白中存儲，維持細胞鐵元素平衡。自噬可降解FTH1/FTL1復合物，釋放大量Fe2+，增加細胞內鐵水平，促進鐵死亡。鐵死亡是一種具有鐵依賴性的、通過細胞膜上過載的脂質過氧化引發的細胞死亡方式［17］。鐵死亡的生物特征主要有細胞線粒體皺縮、嵴減少、膜密度升高、線粒體膜破裂增加、谷胱甘肽耗竭及細胞內Fe2+和ROS 的聚積等［18］。脂質過氧化的過程依賴于GPX4 的失活。PARK 等［19］研究發現，抑制GPX4表達可導致細胞內發生鐵介導的過氧化反應，從而誘導鐵死亡。HU等［20］發現，GPX4 可保護造血干細胞及祖細胞免受脂質過氧化和鐵死亡。本研究結果提示，羅哌卡因作用于軟骨細胞后，可導致細胞中FTH1 表達減少，GPX4活性抑制，最終引發軟骨細胞發生鐵死亡。
綜上所述，羅哌卡因可誘導軟骨細胞發生損傷，降低細胞活力，破壞細胞形態，增強氧化應激，導致線粒體功能障礙，且作用呈劑量依賴性；
羅哌卡因對軟骨細胞的損傷誘導作用可能與上調細胞自噬水平和誘導鐵死亡有關。然而，本研究為體外實驗，羅哌卡因在體外和體內的擴散具有一定差異，后續我們將繼續進行動物實驗來驗證以上結論。