彭燕瓊 彭毅 楊彬 廖倩 王月 杜榮 胡漢華 孫環 馬艷
(1武漢市第一醫院公共衛生科，湖北 武漢 430000；
2湖北省腫瘤醫院消化科；
3武漢市第一醫院康復醫學科)
絕經后骨質疏松(PMOP)是中老年婦女常見的一種全身性代謝性骨科疾病，病理特征以骨密度(BMD)減少，骨微結構破壞，骨脆性增加，骨強度降低為主，導致患者易發生骨折，明顯增加中老年婦女病殘、病死率〔1，2〕。丹參素是中藥丹參中的多酚類活性成分，具有減輕細胞凋亡、抑制炎癥的作用，可上調骨保護素(OPG)的表達，增強成骨細胞增殖分化，抑制其凋亡，促進牙槽骨成骨形成，并增加骨質疏松大鼠BMD，改善其臨床癥狀〔3，4〕，但其藥理機制目前還未研究清楚。轉化生長因子(TGF)-β/Smad信號通路在成骨分化過程中起著直接而關鍵的作用，上調TGF-β1表達，可提高Smad3磷酸化水平，增強成骨細胞功能，促使骨形成，減輕骨量丟失，明顯改善糖皮質激素及卵巢功能減退引起的骨質疏松癥狀，因此TGF-β/Smad信號可作為骨質疏松的一個重要治療靶點〔5～7〕。丹參素是否可調控卵巢去勢骨質疏松大鼠TGF-β/Smad信號通路的表達，目前還未見報道。本文丹擬分析參素對卵巢去勢骨質疏松大鼠TGF-β/Smad信號通路的影響。
1.1動物 SD大鼠購自廣州相觀生物科技有限公司，許可證號SCXK(粵)2018-0043，清潔級，雌性，體重(200±20)g，所有大鼠在安靜、通風良好的動物房中飼養，室內環境保持清潔級，溫度25℃，相對濕度55%，12 h/12 h間斷照明，大鼠自由進食、飲水。
1.2主要試劑及儀器 丹參素，純度：≥98%，貨號E-1147，購自上海同田生物技術股份有限公司；
雌激素(戊酸雌二醇片)，國藥準字J20130009，購自拜耳醫藥保健有限公司;大鼠OPG酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、大鼠核因子κB受體活化因子配體(RANKL)ELISA檢測試劑盒，貨號E2015-1102B、E20151102B，購自上海源葉生物科技有限公司；
兔源抗TGF-β1一抗、抗p-Smad3一抗、抗Smad3一抗、抗GAPDH一抗、羊抗兔二抗，貨號ab215715、ab40854、ab63403、ab181602、ab150077，購自美國Abcam公司；
RIPA裂解液、BCA試劑盒，貨號為P0013K、P0011，購自上海碧云天公司等。雙能X線骨密度測量儀，型號LUNAR-Prodigy，購自美國GE公司；
骨科生物力學測試儀，型號MX-0580，購自江蘇摩信工業系統有限公司；
灰化爐，型號F30400-60，購自賽默飛世爾科技公司；
酶標儀，型號XElx800，購自美國 Perkin Elmer 公司；
蛋白電泳儀、轉膜儀，型號1659001、Trans-Blot Turbo，購自美國Bio-Rad公司；
低溫高速離心機，型號Centrifuge 5424R，購自德國Eppendorf股份公司；
凝膠成像儀，型號GIS-500，購自Miulab公司等。
1.3方法
1.3.1動物模型制備及分組給藥 參考文獻〔8〕制備大鼠模型：腹腔注射30 mg/kg的5%戊巴比妥鈉溶液，對SD大鼠進行麻醉，俯臥位固定于操作臺，經背部開腹，移除雙側卵巢，止血后縫合、消毒，5 w后，檢測大鼠股骨BMD明顯降低，表明模型制備成功。共建模64只，成功60只，隨機分為模型組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組、雌激素組，每組12只，另取12只SD大鼠僅做背部開腹處理，不移除雙側卵巢，設為假手術組。
參照文獻，以生理鹽水溶解丹參素和雌激素，制備為1、2、4 mg/ml的丹參素〔9〕溶液及0.009 mg/ml的雌激素〔10〕溶液，藥物處理組以10 ml/kg的劑量灌胃，假手術組與模型組大鼠以同劑量生理鹽水灌胃，每天1次，持續28 d。
1.3.2大鼠股骨BMD檢測及標本收集 末次給藥結束后24 h，采用注射器經尾靜脈取血2 ml，靜置10 min，4℃，1 000 r/min，離心15 min，收集上清液，得到血清，儲存在-80℃冰箱中備用；
以吸入乙醚的方法麻醉大鼠，處死分離兩側股骨，去除附著組織后，置于生理鹽水中漂洗干凈，右側股骨備用，采用BMD測量儀檢測大鼠左側股骨BMD，然后截斷股骨，用刮匙刮取斷面處約0.5 g骨組織，置于RIPA裂解液中，以勻漿機制備為勻漿液，4℃，1 000 r/min，離心20 min，取上清液，采用BCA法測定其中總蛋白濃度(具體步驟參照說明書進行)，然后將各組蛋白濃度調整相同后，儲存在-80℃冰箱中備用。
1.3.3大鼠股骨骨生物力學檢測 將1.3.2中的右側股骨放置在骨科生物力學測試儀的兩個支撐點上，保持水平，跨度為20 mm，然后下壓探頭至股骨中段，速率為10 mm/min，直至其斷裂，以儀器自帶的軟件記錄并分析數據，獲得骨生物力學指標彈性模量、最大載荷、屈服載荷的數值。
1.3.4大鼠骨礦物鹽含量檢測1.3.2中的左側股骨放置在烤箱中烘烤，直至重量不再變化，記錄最后一次重量，記為干重，然后將其轉移至灰化爐中灰化，650℃，36 h，取出灰分稱量，得出灰分重量，骨礦物鹽含量=灰分重量/干重。
1.3.5大鼠RANKL、OPG水平檢測 取出1.3.2中血清，置于冰水浴中解凍，以ELISA試劑盒檢測其中RANKL、OPG水平，具體步驟參照說明書進行。
1.3.6大鼠骨組織TGF-β/Smad通路蛋白表達檢測 取出1.3.2中蛋白樣品液，煮沸變性后，各組取15 μl上樣，進行電泳，濕轉，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，置于5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1 h，封閉，分別以兔源抗TGF-β1一抗、抗p-Smad3一抗、抗Smad3一抗、抗GAPDH一抗溶液于4℃孵育過夜(稀釋比例分別為1∶2 000、1∶2 500、1∶1 000、1∶5 000)，TBST溶液洗膜，以羊抗兔二抗溶液于室溫孵育2 h(稀釋比例為：1∶2 000)，TBST溶液洗膜，以增強化學發光法顯色，使用凝膠成像儀對蛋白條帶拍照，并采用ImageJ軟件分析圖片，得出蛋白相對表達水平。
1.4統計學分析 采用SPSS24.0軟件單因素方差分析、LSD-t檢驗。
2.1丹參素對大鼠股骨BMD的影響 與假手術組相比，模型組BMD明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組BMD升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)，丹參素高劑量組和雌激素組BMD差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。
2.2丹參素對大鼠股骨生物力學的影響 與假手術組相比，模型組彈性模量、最大載荷、屈服載荷明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組彈性模量、最大載荷、屈服載荷升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；
丹參素高劑量組和雌激素組彈性模量、最大載荷、屈服載荷差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。
表1 各組股骨BMD及彈性模量、最大載荷、屈服載荷比較
2.3丹參素對大鼠股骨骨礦鹽含量的影響 與假手術組相比，模型組骨礦鹽含量明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組骨礦鹽含量升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；
丹參素高劑量組和雌激素組骨礦鹽含量差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。
2.4丹參素對大鼠血清RANKL和OPG水平的影響 與對照組相比，模型組血清OPG水平明顯降低，RANKL水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組血清OPG水平升高，RANKL水平降低，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；
丹參素高劑量組和雌激素組血清RANKL、OPG水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。
2.5各組骨組織TGF-β/Smad通路蛋白表達比較 與假手術組相比，模型組骨組織TGF-β/Smad通路TGF-β1蛋白表達、p-Smad3/Smad3顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組骨組織TGF-β1蛋白表達、p-Smad3/Smad3升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；
丹參素高劑量組和雌激素組骨組織TGF-β1蛋白表達、p-Smad3/Smad3差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖1。
表2 各組股骨骨礦鹽含量、血清RANKL、OPG水平及骨組織TGF-β/Smad通路蛋白相對表達比較
1～6：假手術組、模型組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組、雌激素組圖1 免疫印跡檢測各組骨組織TGF-β/Smad 通路蛋白表達
女性步入老年進程時，卵巢功能衰退，體內雌激素水平降低，破壞機體骨代謝平衡，上調RANKL表達，促進骨吸收，下調OPG表達，抑制骨形成，進而引發骨量減少，BMD降低，最終導致PMOP〔11～13〕。去除雙側卵巢是復制PMOP動物模型常用的方法，操作簡便，成功率高〔14〕。本文結果表明，摘除大鼠雙側卵巢，可下調OPG表達，上調RANKL表達，降低BMD，減輕骨礦化，破壞骨生物力學，造成骨丟失，揭示模型建立成功。
骨質疏松的臨床治療藥物以維生素D、鈣劑、雌激素等為主，其中雌激素是治療PMOP最常用的藥物，但其長期療效并不理想，且可增加乳腺癌和心血管疾病的患病風險，因而，尋找一種安全有效的新型藥物具有重要的臨床意義〔10，15,16〕。丹參素是提取自丹參的有效成分之一，對炎癥反應、細胞增殖分化、骨代謝過程具有調節作用，可降低RANKL/OPG比值，抑制破骨細胞形成，防治牙槽骨吸收，并促進成骨細胞增殖，增強骨形成，明顯改善骨質疏松狀〔17,18〕。本文結果表明丹參素可下調RANKL表達，促進OPG表達，增強骨礦化，提高骨密度，改善骨生物力學損傷癥狀，并隨劑量升高而作用增強，進一步證實了丹參素對骨質疏松的療效。
TGF-β/Smad信號對骨代謝平衡具有關鍵的調控作用，是治療骨質疏松的一個重要治療靶點。研究顯示，在骨質疏松病理進程中，TGF-β/Smad信號傳導受到抑制，淫羊藿和女貞子水煎液可上調TGF-β1表達，增強Smad3磷酸化，抑制骨吸收，促進骨形成，緩解糖皮質激素性骨質疏松大鼠骨生物力學特性及小梁結構的損傷〔19〕。郝喆等〔20〕發現，敲除卵巢去勢小鼠白細胞介素(IL)-31基因，可明顯激活TGF-β/Smad信號，抑制成骨細胞凋亡，促進成骨形成，顯著抑制骨質疏松的進展，改善其臨床癥狀。本文結果表明，丹參素可激活該通路，促使Smad3磷酸化，提高卵巢去勢骨質疏松大鼠骨密度，改善其骨量減少癥狀。
綜上所述，丹參素可上調TGF-β表達，增強Smad3磷酸化，調控RANK-OPG通路表達，降低RANKL/OPG比值，增強骨礦化，促使骨形成，提高BMD，緩解骨生物力學受損，改善卵巢去勢骨質疏松大鼠骨量丟失癥狀，激活TGF-β/Smad信號可能是其藥理機制。但未對TGF-β/Smad信號下游調控機制進行深入研究，且亦未激活或抑制該通路進行對照驗證，需后續進行深入研究。
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