摘要：選取分離于鯉細菌性敗血癥病例的嗜水氣單胞菌強毒力菌株進行復壯，于菌懸液中加入0.2% 甲醛于28 ℃ 滅活12 h制成滅活疫苗，對鯉進行免疫接種后，通過檢測抗體, 以確定魚體對疫苗的應答強度。分別取注射免疫后第21，28，35，42天的血清做凝集試驗，并于首免6周后做人工感染保護試驗。結果抗體最高效價達到 212，而對照組為0。受免組攻毒免疫保護率達90%，表明魚體對嗜水氣單胞菌滅活疫苗可以產(chǎn)生免疫應答, 對鯉有一定的免疫保護作用。
關鍵詞：細菌性敗血癥；鯉；免疫
中圖分類號：S941.42+9文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.027
Immunological Study of Bacterial Septicemia in Carp
ZHANG Yu-fen1,2, ZHANG Wen-li1,LI Xu-kun1,YANG Sen1, ZHANG Xiu-jun1
(1.Fengrun Center of Disease Control and Prevention ,Tangshan, Hebei 064000, China; 2.Department of Life Science, North China Coal Medical College, Tangshan, Hebei 063000, China)
Abstract：Bacterial liquid were obtained after rejuvenating from selected strong virulence strains ofAeromonas hydrophila isolated from bacterial septicemia of carp, which was made into vaccine by inactivating it with 0.2% formaldehyde at 28 ℃ for 12 hours. The inactivated vaccine was inculated carps through abdominal cavity. The intensity of response in fish to stimulation of vaccine was determined through examine immune antibody. Examination of the agglutinating antibody titers on the 21th , 28th , 35th , 42th days after vaccination showed that the highest titer of the immunized carp was 212, while that of the control was 0, antibody levels were significatly different between immunized group and control group(P<0.05). The relative percent survival of the immuned group was 90% by experiments about protection to artificial infections by immuned six weeks later. The resuls showed that fish which was immuned could create 9 times immune antibody response to immune of inactivated vaccine of Aeromonas hydrophila, had a certain protective effective effect on Carp.
Key words: bacterial septicemia；carp；immune
細菌性敗血病(bacterial septicemia)20世紀70年代始發(fā)于日本，80年代在中國臺灣流行，1989 年傳入中國大陸[1]。自 1989 年以來，各種淡水魚類細菌性敗血病頻繁發(fā)生[2-6]。嗜水氣單胞菌為本病的主要病原菌，廣泛分布于池塘、溪、澗、江、河、湖泊和鄰泊河口等淡水環(huán)境，因此感染范圍也十分廣泛。目前，越來越多的水產(chǎn)學專家研究疫苗用于防治魚類細菌性敗血癥。為探討疫苗的防治效果，筆者采用自然患細菌性敗血癥的鯉 (Cyprinus Carpio Linnaeus) 中分離出強毒株，制成滅活菌苗，以注射方式進行免疫接種，用凝集試驗檢測了免疫后鯉體內(nèi)的血清抗體水平，并進行了攻毒保護試驗，現(xiàn)將研究結果報告如下。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)菌株，自患細菌性敗血病的鯉體內(nèi)分離，本實驗室分離、保存。
1.1.2試驗動物供試鯉，購自唐山某農(nóng)貿(mào)市場。
1.1.3培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂由杭州天和微生物試劑有限公司提供；甲醛由信陽市化學試劑廠提供；96孔板購自美國Costar公司。
1.2 方法
1.2.1菌株的復壯及 LD50 的測定保存嗜水氣單胞菌菌株活化后，接種于營養(yǎng)肉湯 28℃ 搖床培養(yǎng) 24 h，取菌體濃度約為 2.5×109 cfu·mL-1 的培養(yǎng)物 0.5 mL 腹腔注射鯉 3 條，于水族箱中飼養(yǎng)觀察發(fā)病情況。無菌條件下解剖瀕死鯉，平板劃線離單菌落，進行鑒定，并以此菌株作為生產(chǎn)菌種。
將試驗魚分成4組，每組4尾，將濃度為 2.5×109 cfu·mL-1 的復壯后的菌液以 10-1，10-2，
10-3，10-4 倍比稀釋，每稀釋度菌液腹腔注射鯉 0.5 mL，同時設生理鹽水對照。試驗魚養(yǎng)于塑料缸內(nèi)，充氣，定期清污換水。認真觀察記錄 7 d 內(nèi)試驗魚的發(fā)病及死亡情況，參考 Reed-Muench 法計算半數(shù)致死量 (LD50) 。
1.2.2疫苗的制備將菌種接種到加有 1% 胰蛋白胨、pH 為7.5的普通肉湯中，180 r·min-1、28 ℃ 搖床培養(yǎng) 18 h 后，加 0.2% 甲醛，28℃ 培養(yǎng) 12 h，制得嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，采用常規(guī)方法進行無菌檢查，再用嗜水氣單胞菌全菌苗雙倍濃度腹腔注射6尾鯉進行安全檢驗。
1.2.3鯉免疫方案隨機抽取150~200 g的健康魚140條，暫養(yǎng)2周后分為2組，1組為注射組，2組為對照組。其中，注射組為腹腔注射 0.2 mL濃度為 3×108 cfu·mL-1的和完全佐劑混合的滅活疫苗，兩周后，進行二次免疫。二次免疫時注射 0.2 L濃度為 3×108 cfu·mL-1的滅活疫苗。對照組為腹腔注射 0.2 L生理鹽水。
1.2.4血清的采集健康魚二次免疫后，每隔7 d各組魚中隨機取4條，注射器尾靜脈穿刺采血，以8 089 r·min-1、4℃ 離心 15 min，分離血清備用。
1.2.5血清抗體效價的檢測將嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液12 000 r·min-1 離心后用等量生理鹽水重懸，將菌懸液置于 37 ℃條件下水浴加溫0.5 h；將待檢血清在96孔微量滴定板上依次梯度稀釋，最后1個孔為生理鹽水對照孔；用微量移液器于第1孔中加入80 μL生理鹽水，其余各孔加 50 μL ；向第1個孔中加入20 μL 的抗血清，吹吸混勻后取 50 μL 加入第2孔，再混勻后從第 2 孔取 50 μL 加入第3孔，依此類推至倒數(shù)第2孔，棄去50 μL，最后1孔作為對照孔；向每個孔中加入50 μL嗜水氣單胞菌懸液，吹吸混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h，放置在4 ℃條件下過夜，觀察結果。
1.2.6攻毒保護試驗在首次免疫后第6周，以LD50 嗜水氣單胞菌攻擊各免疫組魚，同樣環(huán)境養(yǎng)殖7 d，觀察死亡魚數(shù)，計算各組魚的相對存活率。
相對存活率(RPS)=×100%
1.2.7田間試驗在陡河水庫某養(yǎng)殖場進行，分為試驗組和對照組，按實驗室免疫程序注射疫苗，記錄細菌性敗血癥流行季節(jié)鯉的發(fā)病、死亡情況。試驗中投餌、施肥、排水按魚場規(guī)定統(tǒng)一管理。
1.2.8統(tǒng)計方法 采用 SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P<0.05 時，結果有統(tǒng)計學意義。
2結果
2.1菌株復壯的結果
受試鯉全部死亡，主要癥狀為兩眼突出，腹部膨大，魚體兩側及腹側充血發(fā)紅，少數(shù)病變嚴重的鯉用手觸摸體表，鱗片即脫落。剖檢病魚：肝臟蒼白，質地脆弱，膽囊高度充盈，脾臟呈暗黑色，腹腔有大量淡紅色腹水。
普通營養(yǎng)瓊脂平板上為單一純菌落，特征為無色，半透明，圓形，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，無水溶性色素，經(jīng)鑒定為嗜水氣單胞菌。
根據(jù)鯉的死亡情況，由Reed-Muench 法計算出其LD50 為2.5×107 cfu·mL-1。
2.2疫苗安全性實驗
將制備好的疫苗進行無菌檢查，無任何菌落生長，也無溶血環(huán)產(chǎn)生。將疫苗腹腔注射(0.2 mL·尾-1)健康鯉，7 d 內(nèi)全部存活，且未見異常反應，顯示疫苗的安全性良好。
2.3 血清凝集抗體效價的測定
由圖1可知，鯉在經(jīng)注射免疫后，于第 35 天凝集效價達到高峰，之后開始下降。免疫組血清中的凝集抗體效價與對照組的比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.4實驗室攻毒保護試驗
由表1可知，在注射免疫試驗組中，鯉累計死亡3條，存活率為 90.0%，免疫保護率為 90.0%。在對照組中，鯉全部死亡，存活率為0。根據(jù)各組鯉存活率的分析，發(fā)現(xiàn)免疫組的攻毒保護效應與對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.5田間攻毒保護試驗
由表2可知，在注射免疫試驗組中，鯉的存活率為78.0%，在對照組中，鯉的存活率為18.0%。兩組鯉攻毒保護效應的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3討論
（1）本試驗所用的嗜水氣單胞菌菌株為從患病魚提取，其半數(shù)致死量為 2.5×107 cfu·mL-1，毒力較強。
（2）采集鯉的血液，檢測血清中的抗體水平，結果表明，鯉在免疫21~42 d內(nèi)均能檢測到抗體，而對照組抗體效價為0。說明采用甲醛滅活所制疫苗能使鯉產(chǎn)生免疫應答，可起到了很好的保護作用。
（3）實驗室攻毒保護實驗受免魚的免疫保護率達90%，與他人試驗結果相比[7-13]，此疫苗效果尚可。
（4）田間攻毒試驗中受免組免疫保護率為78%，而對照組為18%，和實驗室攻毒試驗結果相比有些差別，出現(xiàn)這一試驗結果可能有以下幾方面的原因：實驗室試驗魚的樣本量較小，對結果有一定的影響;受免魚在進行免疫時，可能造成人為的損傷，如捕撈、工作人員不同的注射方式等，導致試驗魚的死亡；試驗魚在漁場養(yǎng)殖時，工作人員所投喂的飼料中添加了某些抗感染藥物，使對照組的免疫保護率提高。
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