[摘要] 目的 探討高壓氧對急性一氧化碳中毒大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10 mRNA表達的影響。 方法 體外純化培養新生大鼠皮層少突膠質細胞前體細胞（OPCs），按3種處理方式分為對照組、急性一氧化碳中毒組（ACOP組）、高壓氧組（HBO組）。對照組不進行任何處理；ACOP組將細胞放在密閉容器內，根據體積比例注入1%一氧化碳；HBO組將一氧化碳處理的OPCs放入動物實驗艙中，以98%O2、2%CO2洗艙10 min，然后15 min內加壓至0.35 MPa并停留2 h，20 min內減至常壓，處理期間艙溫控制在37℃，余處理同ACOP組。以HBO處理后即刻為0 h，三組均在6、24 h和48 h時間點取材；采用RT-PCR方法觀察不同時間點OPCs細胞ADAM10 mRNA的表達。 結果 在6、24 h和48 h三個時間點，大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10 mRNA在對照組無明顯變化，ACOP組逐漸減少，HBO組逐漸增多，差異有統計學意義（F = 8.491，P < 0.01）；與對照組在6、24 h和48 h三個時間點大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10 mRNA水平比較，ACOP組均明顯減少，HBO組均明顯增加（F = 88.692，P < 0.01）。 結論 大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10分子在一氧化碳中毒造成的腦白質損傷及高壓氧治療中發揮重要作用。
[關鍵詞] 高壓氧；一氧化碳中毒；少突膠質細胞前體細胞；ADAM10
[中圖分類號] R595.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（b）-0009-04
[Abstract] Objective To investigate the effect of hyperbaric oxygen （HBO） treatment on the xpression of Oligodendrocyte Precursors （OPCs） ADAM10 mRNA in the acute carbon monoxide poisoning（ACOP） rats. Methods OPCs cells of neonatal rat were cultured in vitro and divided into three groups： control， ACOP and HBO groups. Control group： no treatment， ACOP group： the OPC cells were placed in a sealed container and injected with 1% carbon monoxide according to the volume ratio， HBO group： OPCs cells after ACOP were placed in animal experiments of hyperbaric oxygen chamber， with 98% O2， 2%CO2 washing 10 min， then 15 min 0.35 MPa pressure staying 2 h， at last 20 min reducing to normal pressure. The chamber temperature was controlled at 37℃. The end time of HBO treatment was set as 0 h， the three groups were collected at 6 ， 24 h and 48 h for subsequent experiments. The expression of ADAM10 mRNA at 6， 24 h， and 48 h were detected by RT-PCR. Results 6， 24 h， and 48 h， the expression of ADAM10 mRNA was no change in control group， but gradually decreased in ACOP group， and increased in HBO group， there was statistically significant among the three groups （F = 8.491， P < 0.01）. Compared with control group， the expression of ADAM10 mRNA at 6， 24， 48 h was significantly reduced in ACOP group， while was significantly increased in HBO group （F = 88.692， P < 0.01）. Conclusion ADAM10 of OPCs may play an important role in the injury of central nervous system after ACOP and HBO.
[Key words] Hyperbaric Oxygen； acute carbon monoxide poisoning； Oligodendrocyte precursors； ADAM10
急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP）是最常見的職業性及生活性中毒之一，可造成全身多個臟器損害，其中以中樞神經系統（central nervous system，CNS）損傷危害最大，造成巨大社會、經濟負擔[1]。一氧化碳中毒遲發性腦病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）是ACOP后最主要的神經精神后遺癥，表現為部分患者急性中毒癥狀消失以后，經過數天或數周表現正常或接近正常的假愈期后又出現以癡呆為主的精神、神經癥狀。腦白質脫髓鞘改變是DEACMP最顯著的病理學和顱腦影像學表現，但其機制仍不清楚[2]。
ADAM10是解聚素和金屬蛋白酶（A Disintegrin And Metalloproteinase，ADAM）家族的重要一員，具有調節細胞黏附和金屬蛋白酶雙重功能，參與發育等諸多生理病理過程，是阿爾茲海默病、腫瘤、炎癥等疾病的潛在治療靶點[3]。已有研究發現，ADAM10不但在外周神經系統（peripheral nervous system，PNS）的雪旺氏細胞有表達，而且在CNS的少突膠質細胞前體細胞（Oligodendrocyte Precursors，OPCs）和少突膠質系細胞（Oligodendrocyte，OLs）也有表達[4]。鑒于ADAM10蛋白的分布特點，結合DEACMP最主要病理特征是白質脫髓鞘病變，我們推測ADAM10可能參與ACOP后脫髓鞘病變的病理生理過程。
高壓氧（Hyperbaric Oxygen，HBO）是治療ACOP和DEACMP的重要方法之一。有研究表明，HBO可促進ACOP后損傷髓鞘再生，還具有誘導神經干細胞分化的功能[5-6]。我們前期研究發現，ACOP導致大鼠OPCs增殖和分化能力下降，HBO可一定程度改善OPCs的功能，但機制仍不清楚[7]。因此，本實驗采用差速貼壁法體外純化培養大鼠OPCs，建立OPCs的ACOP細胞模型，觀察高壓氧對ACOP后OPCs細胞ADAM10 mRNA水平的影響，探討HBO治療ACOP后髓鞘損傷和DEACMP可能的神經保護作用機制。
1 材料和方法
1.1 動物與試劑
實驗用SD大鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心，新生鼠（P0），動物合格證號：SGXK（京） 20022003。胎牛血清、DMEM/HIGH GLUCOSE培養液、N2 supplement（100×）、胰蛋白酶、B27 supplement（50×）、DMEM/F12購自美國GIBCO公司；多聚賴氨酸（poly-lysine，PLL）、DAPI試劑購自美國Sigma公司；Rat FGF、Human PDGF-AA購自Peorotech公司；RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司。
1.2 體外OPCs純化培養
新生SD大鼠經75%乙醇消毒后，用眼科剪和眼科鑷取腦，在PBS液中充分漂洗，剔除腦膜，腦組織用眼科剪剪成小塊，置于37℃ 0.125%胰酶中消化10 min，含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，用巴氏管反復吹打腦組織使其分散成細胞懸液，細胞懸液用200目的篩網過濾，過濾后懸液置于4℃的低溫離心機中以1600 r/min的速度離心8 min，棄去上清液，用培養基重懸細胞沉淀，接種于用多聚賴氨酸預包被的細胞培養瓶中，置于普通細胞培養箱（37℃、5%CO2）中培養，次日更換培養基，每3～4天換液1次，直至混合膠質細胞長滿培養瓶底（約10 d）。待混合膠質細胞長滿培養瓶瓶底后，擰緊培養瓶瓶蓋，并用封口膠封閉瓶口，將培養瓶置于37℃恒溫搖床振搖，設參數為200 r/min，先預振搖2 h，然后棄上清，更換新的培養基，繼續置于37℃恒溫搖床振搖，參數不變，振搖16～20 h后轉移振搖后的細胞上清，種于未包被的100 mm培養皿（Corning）中，置于37℃ 5%CO2培養箱中，靜置貼壁30 min，吸取上清，收集上清于離心管中800 r/min離心5 min，棄去上清，用OPCs培養基（含10 ng/mL PDGF-AA、10 ng/mL FGF、1×N2、1×B27的DMEM/F12培養基）重懸后，種于含有PLL預包被的蓋玻片的24孔板及96孔板中。OPCs隔天換液。
1.3 實驗分組及處理
OPCs純化培養3 d后，將細胞分為三組：對照組、ACOP組和高壓氧組。①對照組：無CO處理；②ACOP組：將細胞放在密閉容器內，根據體積比例注入1%CO（用一氧化碳檢測儀檢測，容器內一氧化碳濃度為10 000 ppm）；③HBO組：將一氧化碳處理的OPCs放入動物實驗艙中，以98%O2、2%CO2洗艙10 min，然后15 min內加壓至0.35 MPa并停留2 h，20 min內減至常壓，處理期間艙溫控制在37℃，余處理同ACOP組。以HBO處理后為0 h，三組均在6、24 h和48 h取材進行后續實驗。
1.4 RT-PCR測定ADAM10 mRNA表達
培養終止，三組培養皿中加入Trizol將細胞消化，常規提取總RNA。紫外分光光度計進行測定A260/A280，計算總RNA含量和純度>1.8；瓊脂糖凝膠電泳可見完整18S、28S兩條帶，表明總RNA完整未降解。取250 ng總RNA按反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄為cDNA，而后加入ADAM10、GAPDH上下游引物進行PCR反應。反應條件為95℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環，后72℃延伸10 min。取PCR反應產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠分析系統儀分析ADAM10和GAPDH的吸光度值（A），計算ADAM10和GAPDH積分吸光度的比值，作為ADAM10 mRNA的表達水平，引物序列如表1。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
三組各時間點大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10 mRNA表達在對照組無明顯變化，ACOP組逐漸減少，HBO組逐漸增多，組內比較差異有統計學意義（P < 0.01）。與對照組各時間點大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10 mRNA水平比較，ACOP組均明顯減少，HBO組均明顯增加，組間比較差異有統計學意義（P < 0.01）。見表2、3。
3 討論
CNS髓鞘由OLs纏繞軸突形成。當CNS髓鞘損傷時，OPCs會迅速增殖并向損傷部位遷移，分化成為成熟的OLs，進行髓鞘修復[8]。然而，這一過程受到諸多因素影響。ADAM10被認為是神經細胞分化、遷移過程的關鍵因素之一，筆者一直致力對ADAM10在CNS脫髓鞘/再生中的作用和機制進行深入研究。ADAM10是ADAM分子家族中重要一員，在CNS中主要分布于大腦皮質、海馬、下丘腦和小腦皮質。ADAM10基因敲除小鼠通常在胚胎期第9.5天（E9.5）左右死亡，體型僅占正常小鼠的2/3，且CNS發育、心血管系統發育、體節形成和血管發生存在明顯缺陷[9]。進一步研究發現，ADAM10敲除小鼠在神經系統中觀察到的異常主要表現為神經上皮細胞壁的不完整，與Notch/Delta信號缺陷小鼠的表型十分相近[10]。ADAM10在多發性硬化病患者的星形膠質細胞和血管周圍的巨噬細胞中表達上調，表明炎癥或白質退行性變可以通過增加ADAM10表達來激活炎性細胞因子[11]。ADAM10在胚胎晚期、出生早期的CNS神經元中表達升高[12]。而這一發育階段正是星形膠質細胞和少突膠質細胞增殖和/或分化的關鍵時刻，提示ADAM10可能參與到這一過程。此外，在果蠅生長錐和細胞遷移過程中，ADAM10能夠激活Slit/Robo復合物促進室管膜下區的成神經細胞遷移[13]。這些研究結果表明ADAM10在CNS的髓鞘發育和損傷修復過程中起到非常重要的作用。
Thom等[14]發現在ACOP后大鼠腦內MBP表達減少，提示CO中毒可導致脫髓鞘改變。孫瑞佼等[15]研究發現ACOP后大鼠發生CNS脫髓鞘及OPCs損傷。Wang等[16]研究發現，大鼠CO中毒后OLs形態發生改變，細胞突起增生、肥大，與星形膠質細胞的激活相似，且數量隨損傷時間的增加而逐漸減少。我們前期研究發現，ACOP大鼠OPCs細胞的增殖、分化和遷移功能明顯下降[7，17]。HBO作為治療急性CO中毒及其相關腦病重要方法之一，具有確切的理論和臨床基礎[18-19]。目前認為機制包括：縮短CO排除半衰期，迅速降低碳氧血紅蛋白水平；收縮腦血管，降低顱內壓，減輕腦水腫；加速CO與細胞色素氧化酶解離；抑制β2黏附聚集因子介導的白細胞黏附，改善CO介導的CNS損傷相關病理反應，抑制脂質過氧化，減輕白細胞黏附對血管內皮損傷等[20]；促進星形膠質細胞合成和分泌神經生長因子（nerve growth factor，NGF），腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神經營養素-3（neurotrophin-3，NT-3）的能力[21]。由于ADAM10在CNS生理病理過程中發揮重要功能，我們猜想HBO可能通過ADAM10來影響OPCs細胞功能，從而促進ACOP后髓鞘損傷修復。本次實驗采用差速貼壁法體外純化培養大鼠OPCs，建立OPCs的ACOP細胞模型，研究高壓氧對ACOP后OPCs細胞ADAM10 mRNA水平的影響，結果發現：各時間點大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10 mRNA表達在對照組無明顯變化，ACOP組逐漸減少，HBO組逐漸增多；與對照組各時間點大鼠少突膠質細胞前體細胞ADAM10 mRNA水平比較，ACOP組均明顯減少，HBO組均明顯增加。
本研究提示，HBO很可能通過ADAM10分子信號通路影響OPCs細胞功能，參與CNS髓鞘損傷與修復過程，這可能在闡明ACOP后CNS損傷和DEACMP的發生、發展、預后及高壓氧治療靶點中具有重要意義。然而，本研究僅觀察了ADAM10 mRNA水平的變化特點，不能夠代表蛋白表達情況，也未研究ADAM10分子與ACOP及HBO后OPCs細胞功能和CNS髓鞘損傷修復的關系，將來有必要通過多種實驗手段進一步闡明這一機制。
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