醫師重新切片診斷，進一步行病理學分級，分別實施Pyk2、Twist和MMP-7免疫組織化學染色，應用免疫組化檢測Pyk2、Twist和MMP-7蛋白的表達。兔抗人Pyk2單克隆抗體、兔抗人Twist多克隆抗體及兔抗人MMP-7多克隆抗體（均購自美國Santa Cruz公司），工作濃度均為1∶200。EnVision試劑盒（購自丹麥Dako公司），操作步驟按試劑盒說明書進行。同時設立陽性和陰性對照：陽性對照為試劑公司提供的強陽性標本切片，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照。
1.3 判定標準 Pyk2蛋白陽性：細胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒；Twist蛋白陽性：細胞質內出現棕黃色顆粒；MMP-7蛋白陽性：細胞質內出現棕黃色顆粒。在不知任何背景資料的情形下，由兩位病理專家采用雙盲法進行閱片。首先依據染色強度打分：無染色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分（染色需與背景著色相比較）。再將陽性細胞所占的百分比進行打分：無陽性細胞記為0分，陽性細胞所占百分比（1%～25%）記為1分，陽性細胞所占百分比（26%～50%）記為2分，陽性細胞所占百分比（51%～75%）記為3分；陽性細胞所占百分比（76%～100%）記為4分。最后將染色強度與陽性細胞百分比乘積打分，≥4分記為免疫反應陽性，<4分記為免疫反應陰性。
1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，等級相關檢驗采用Spearman。以P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肝癌組織及癌旁組織中Pyk2、Twist、MMP-7表達的比較 Pyk2陽性染色主要位于細胞質，細胞核未見明顯染色，染色為棕黃色或棕褐色，小片狀或彌漫性分布。兩者Pyk2陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.001）。Twist蛋白的陽性著色位于細胞質，染色為棕黃色顆粒。兩者Twist陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.001）。MMP-7蛋白的陽性著色主要位于細胞質，染色呈棕黃色或棕褐色顆粒。兩組MMP-7陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.001）。見表1。
2.2 Pyk2、Twist和MMP-7蛋白表達與肝癌臨床病理特征的關系 肝癌中Pyk2陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤大小及AFP等均無關（P>0.05）。Pyk2蛋白陽性表達與病理分級、腫瘤分化、血管侵犯及臨床TNM分期均有關（P<0.05）。肝癌組織中Twist陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤大小及AFP等均無關（P>0.05）。Twist蛋白陽性表達與病理分級、腫瘤分化、血管侵犯及臨床分期均有關（P<0.05）。肝癌組織中MMP-7陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤大小及AFP等均無關（P>0.05）。MMP-7蛋白陽性表達與病理分級、腫瘤分化程度、血管侵犯及臨床分期均有關（P<0.05）。Pyk2、Twist及MMP-7共同高表達伴隨肝癌組織分化程度降低、病理分級差及血管侵襲。見表2。
2.3 Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌組織中表達的關系 Spearman等級相關分析發現，肝癌組織中Pyk2與Twist蛋白表達呈正相關（r=0.425，P=0.032），Pyk2與MMP-7的表達亦呈正相關（r=0.498，P=0.026）；Twist與MMP-7的表達亦呈正相關（r=0.302，P=0.041）。
3 討論
Pyk2（proline-rich tyrosine kinase 2）是一種富含脯氨酸的非受體酪氨酸蛋白激酶，定位于人第8號染色體 （ 8p21.1），基因全長4.048 kbp，在腦、腸、脾及腎等多種組織中有表達。Pyk2依賴于鈣離子濃度的變化而被激活，調控細胞增殖、分化及侵襲[8-10]。Pyk2能誘導乳腺癌細胞發生上皮間質轉化，促進腫瘤細胞侵襲和遷移[11]。本研究發現，Pyk2在肝癌組織中高表達，Pyk2在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁肝組織（P<0.05），提示Pyk2基因與肝癌的發生、發展有關。進一步研究還發現Pyk2陽性表達還與病理分級、腫瘤分化、血管侵襲及臨床分期密切均相關，提示Pyk2能在肝癌細胞分化、侵襲轉移過程中發揮重要作用。
Twist是一個新發現的細胞內轉錄因子，不僅在胚胎形態發生中起關鍵作用，還參與調控腫瘤細胞增殖分化、侵襲轉移等過程[12]。胰腺癌中Twist高表達，并且與腫瘤分期、侵襲轉移密切相關[13]。沉默Twist基因后結直腸癌細胞增殖及遷移力顯著下降[14]。本研究結果表明，Twist在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁肝組織（P<0.05）；并且Twist陽性表達還與病理分級、腫瘤分化、血管侵襲及臨床TNM分期均有關（P<0.05），提示Twist在肝癌侵襲轉移過程中發揮重要作用。Twist在低分化、中晚期的肝癌中的表達明顯增強，進一步支持了Twist參與了肝癌惡性進展，這與車娜等[15]研究報道相一致。相關性分析表明，Pyk2與Twist在肝癌中的表達呈正相關（P<0.05），提示Pyk2與Twist共同參與了肝癌惡性侵襲，推測Pyk2可能通過上調Twist促進了肝癌侵襲及轉移。
基質金屬蛋白酶-7（MMP-7）是一種膠原蛋白酶，當MMP-7表達上調，細胞間的黏附力下降，促進腫瘤細胞侵襲及轉移[16-18]。MMP-7在食管癌及乳腺癌組織中高表達，其表達與臨床分期及淋巴結轉移均密切相關[19-20]。本研究結果顯示，MMP-7在肝癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁肝組織（P<0.05）。MMP-7陽性表達還與病理分級、腫瘤分化、血管侵襲及臨床TNM分期均有關（P<0.05）。以上結果表明MMP-7與肝癌侵襲轉移密切相關。本研究還發現Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌組織中異常表達，并且三者密切相關，提示Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌侵襲轉移過程中發揮了協同作用。
綜上所述，本研究發現肝癌組織中Pyk2、Twist和MMP-7表達均與腫瘤病理分級、臨床分期、腫瘤分化程度及血管侵襲密切相關，提示Pyk2、Twist和MMP-7與肝癌的發生發展和侵襲轉移有關。因此，聯合檢測Pyk2、Twist和MMP-7有助于預測肝癌的局部侵襲及轉移，同時也可以作為評估肝癌患者預后的新指標。
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（收稿日期：2016-11-16） （本文編輯：程旭然）