陳玉蘭，趙程成，羅玉婷，范 剛
圓柏為藏醫常用藥材，始載于藏醫經典著作《四部醫典》[1]，具有清熱、消炎、干黃水等功效，常用于治療腎炎、關節炎等疾病。圓柏臨床應用廣泛，可與多種藏藥配伍，在十味訶子丸、二十五味獐牙菜丸、茜草丸等復方中均有使用[2-3]。圓柏具有明顯且獨特的香味，現代研究表明，圓柏藥材的揮性油含量豐富，其中主要成分為萜類及其含氧衍生物，如欖香醇、柏木腦等，這些成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等良好的藥理活性[4-6]。
圓柏為典型的多基原藥材。課題組前期調查發現[7]，目前市場流通及臨床使用較多的品種主要為香柏S.pingiivar.Wilsonii、滇藏方枝柏S.wallichiana、高山柏S.squamata、大果圓柏S.tibetica、祁連圓柏S.przewalskii。目前，關于圓柏藥材的揮發油分析均為單一品種研究。如劉喜梅[5]分析了不同地區、不同海拔祁連圓柏的揮發性成分。涂永勤[6]等和董艷芳[8]等發現香柏揮發油中α-蒎烯等成分的含量較高。這些研究對于圓柏藥材的質量控制具有一定的意義，但圓柏不同品種藥材之間的揮發性成分種類和含量是否存在差異尚不明確。本研究采用GC-MS聯用技術對不同基原圓柏中揮發性成分進行定性分析，并利用主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS-DA）和方差分析，尋找種間差異成分，進行質量評價，研究結果可為圓柏藥材的質量控制和臨床應用提供參考依據。
美國安捷倫7890A-5975C氣相色譜儀質譜儀，色譜柱：Agilent HP-5MS毛細管色譜柱（30 mm × 250 μm × 0.25 μm），Sartorius BP121s 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司)。本研究共收集47批不同品種的圓柏藥材樣品，經重慶市中藥研究院秦松云教授鑒定為滇藏方枝柏S.wallichiana、高山柏S.squamata、香柏S.pingiivar.wilsonii、大果圓柏S.tibetica和祁連圓柏S.przewalskii。詳細信息見表1
表1 圓柏樣品來源一覽表Table 1 Summary table of Sabinae Ramulus sample sources
XB-05 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏農業農村部農產品質量監督檢驗測試中心5.01 XB-06 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏藏醫藥大學附屬醫院 4.29 XB-07 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏國際藏中藥材交易城 4.13 XB-08 香柏S. pingii var. wilsonii 青海省果洛州藏醫醫院4.26 XB-09 香柏S. pingii var. wilsonii青海省稱多縣藏醫院4.96 XB-10 香柏S. pingii var. wilsonii 四川省甘孜藏族自治州康定市康定機場3.95 XB-11 香柏S. pingii var. wilsonii 四川省甘孜藏族自治州康定市加呷臘2.53 XB-12 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏自治區昌都地區芒康縣加尼頂鄉3.33 DZ-01 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省德格縣柯洛洞鄉1.91 DZ-02 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省甘孜州理塘縣兔兒山1.90 DZ-03 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏國際藏中藥材交易城 1.88 DZ-04 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治區林芝市藏醫院（察隅）4.50 DZ-05 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治區林芝縣林芝鎮 4.91 DZ-06 滇藏方枝柏S. wallichiana西藏自治區山南地區5.89 DZ-07 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省甘孜州道孚縣孔色鄉9.90 DZ-08 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省得榮縣中藏醫院3.98 DZ-09 滇藏方枝柏S. wallichiana 云南省德欽縣白馬雪山4.32 DZ-10 滇藏方枝柏S. wallichiana 云南省迪慶州德欽縣升平鎮3.53 DZ-11 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏睿俊芳生物科技發展有限責任公司3.94 DZ-12 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治區林芝市林芝縣魯朗鎮4.67 GS-01高山柏S. squamata青海省海南州貴南縣1.91 GS-02高山柏S. squamata四川省甘孜州德格縣藏醫院1.90 GS-03高山柏S. squamata青海省海東市互助土族自治縣1.91 GS-04高山柏S. squamata青海省藏醫院1.94 GS-05高山柏S. squamata成都國際貿易城中藥材市場 (6-1-1158)3.93 GS-06高山柏S. squamata青海省海南州藏醫院3.91 GS-07高山柏S. squamata青海省黃南州澤庫縣藏醫院3.93 GS-08高山柏S. squamata青海省藥材市場（三智） 3.88 GS-09高山柏S. squamata四川省康定市折多山4.16 GS-10高山柏S. squamata云南省德欽縣白馬雪山2.36 GS-11高山柏S. squamata四川省康定市高爾寺山3.70 DG-01大果圓柏S. tibetica西藏自治區那曲地區藏藥廠3.73
DG-02大果圓柏S. tibetica西藏自治區山南地區3.97 DG-03大果圓柏S. tibetica成都國際貿易城中藥材市場（6-1-0725）3.96 DG-04大果圓柏S. tibetica青海省稱多縣藏醫院4.17 DG-05大果圓柏S. tibetica西藏自治區山南地區5.91 DG-06大果圓柏S. tibetica西藏藏醫學院藏藥有限公司2.99
2.1 圓柏揮發油的提取
取藥材粉末（過三號篩）5 g，按《中國藥典》2020版第四部通則2204揮發油測定法甲法提取揮發油，連續回流5.0 h，至油量不再增加為止，停止加熱，冷卻，收集揮發油，加入少許無水硫酸鈉對揮發油進行干燥，并用正己烷稀釋至一定的濃度，用微孔濾膜過濾，備用。
2.2 GC-MS測定條件
色譜條件：Agilent HP-5MS毛細管色譜柱（30 mm × 250 μm × 0.25 μm），載氣為氦氣；
程序升溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升溫至135 ℃保持0 min，最后以8 ℃/min升至250 ℃，維持10 min。
質譜條件：離子源EI，質量掃描范圍（m/z）：15～350，離子源溫度200 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，采集模式為全掃描。
2.3 揮發性成分的鑒定和統計分析
利用質譜庫 NIST14分析圓柏中的揮發性化合物，通過查詢CAS號及相關參考文獻進行解析，對揮發性成分中檢測到的化合物定性，采用SIMCA-P 14.1軟件進行PCA、PLS-DA分析，并采用GraphPad Prism 5.0軟件進行方差分析。
3.1 不同品種圓柏藥材的揮發油含量及揮發性成分測定結果
47批圓柏藥材的揮發油含量在1.85%～9.90%（ml/g）之間，平均值為3.75%，詳見表1。采用GC-MS技術從圓柏揮發性成分中共鑒定了66個化合物，祁連圓柏、香柏、滇藏方枝柏、高山柏、大果圓柏中鑒定化合物的數量分別為：53個、62個、61個、55個和54個，所鑒定的化合物主要為萜類、酯類、醇類、酮類。欖香醇為各品種均含有且平均含量最高的化合物，含量范圍為3.21%～36.1%，平均含量為17.43%。此外，柏木腦、γ桉葉醇、α-桉葉醇、淚杉醇、β-桉葉醇、十氫-2,7,3,6-二甲烷萘、δ-杜松烯、α-畢橙茄醇、13-表淚杉醇、(4R)-松香-7,13-二烯-18-醛為圓柏揮發油中含量較高的成分，詳見表2。
表2 圓柏的揮發性成分分析結果Table 2 Results of volatile composition analysis of Sabinae Ramulus
Ybh-17月桂酸0.06 0.51 0.33 0.44 0.22 0.31 Ybh-18海松-8(14),15-二烯0.08 0.02 0.08 0.02 0.04 0.05 Ybh-19樅醇0.03 1.07 1.31 0.13 0.66 0.64 Ybh-20(+)-γ-Eudesmol0.22 0.16 0.27 0.05 0.29 0.20 Ybh-21palustral0.08 0.65 0.50 0.02 0.35 0.32 Ybh-22正二十一烷- 0.03 0.44 1.29 0.41 0.43 Ybh-23肉豆蔻酸0.11 0.27 0.09 0.15 0.11 0.15 Ybh-24羅漢柏烯1.12 0.82 0.34 0.28 0.98 0.71 Ybh-25(4aS,4bS,10aS)-1,1,4a-三甲基-7-丙-2-基-2,3,4,4b,5,9,10,10a-八氫菲- 0.14 0.22 - 0.05 0.08 Ybh-26(4R)-松香-7,13-二烯-18-醛0.53 2.89 1.81 - 1.48 1.34 Ybh-27γ-欖香烯0.31 0.16 0.47 0.10 0.86 0.38 Ybh-28 (4aS,4bS,10aS)-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-十二氫-1,1,4a-三甲基-7-(1-甲基亞乙基)-菲0.02 0.11 0.25 - 0.08 0.09 Ybh-29正二十五烷0.18 0.33 0.09 0.41 0.04 0.21 Ybh-30a-桉葉醇3.56 3.85 - 7.18 8.91 4.70 Ybh-31(1E,6E,8S)-1-甲基-5-亞甲基-8-(1-甲基乙基)-1,6-環癸二烯0.47 0.08 0.08 - 0.40 0.21 Ybh-32二十烷0.25 0.10 0.10 0.26 0.34 0.21 Ybh-33 (1S，4S,4aR)-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氫-4-甲基-7-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-萘0.02 0.08 0.12 0.28 0.02 0.10 Ybh-34依蘭油烯0.13 0.06 0.05 0.03 0.06 0.07 Ybh-35 (4aR,4bS,10aR)-1,2,3,4,4a,4b,5,9,10,10a-十氫-1,4a-二甲基-7-(1-甲基乙基)-1-菲甲醛0.06 0.30 0.30 - 0.12 0.15 Ybh-3613-表淚杉醇1.38 2.44 1.68 0.60 0.74 1.37 Ybh-37(1R，4aR，4bS，7R，10aR)-1,4a，7-三甲基-7-乙烯基-1,2,3,4,4a，4b,5,6,7,9,10,10a-十二烷基氫菲-1-甲醛0.05 0.18 0.30 - 0.09 0.12 Ybh-38α-石竹烯0.07 0.09 0.02 0.03 0.03 0.05 Ybh-392-十三烷酮0.31 - 0.02 0.44 - 0.15 Ybh-40阿爾法姜黃烯0.06 0.23 0.05 0.02 0.03 0.08 Ybh-41正二十六烷0.08 0.11 0.11 0.31 0.22 0.17 Ybh-42T-杜松醇0.88 0.84 1.01 0.62 - 0.67 Ybh-43十二甲基環六硅氧烷0.02 0.01 0.04 0.06 0.02 0.03 Ybh-44十八烷0.12 0.10 0.02 0.38 - 0.12 Ybh-45棕櫚酸0.02 0.05 0.42 0.17 - 0.13 Ybh-464,7-二甲基-1-丙烷-2-基-1,2,3,4,5,6-六氫萘- 0.02 2.89 0.11 0.02 0.61 Ybh-47十氫-2,7,3,6-二甲烷萘8.09 4.14 1.55 - - 2.76 Ybh-48α-畢橙茄醇2.48 2.69 0.06 0.64 1.60 1.49 Ybh-491,2,4a,5,6,8a-六氫-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘0.11 0.21 0.10 0.07 0.75 0.25 Ybh-50((1S，4aR，4bR，10aR)-7-異丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10,10a-十氫菲蒽-1-基)甲醇- 0.08 0.08 - 0.05 0.04 Ybh-51十八甲基環九硅氧烷0.03 0.02 0.02 0.17 0.06 0.06 Ybh-52柳杉二醇- 0.09 4.72 - 0.02 0.97 Ybh-53β-桉葉醇- 4.64 0.01 2.58 - 1.45 Ybh-54植物醇- 0.02 0.10 0.09 - 0.04
Ybh-55十四甲基環七硅氧烷0.05 0.04 0.02 0.06 0.11 0.06 Ybh-56大根香葉烯D0.15 0.03 0.14 0.08 0.04 0.09 Ybh-57(1R,4aR,4bS,10aR)-1,4a-二甲基-7-丙-2-亞基-3,4,4b,5,6,9,10,10a-八氫-2H-菲-1-甲醛- 0.06 0.02 0.06 0.02 0.03 Ybh-58(-)-氧化石竹烯- 0.02 0.31 0.18 - 0.10 Ybh-59(1S,4S,4aS)-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,4a,,5-六氫萘- 0.06 - 0.08 - 0.03 Ybh-60(-)-異喇叭烯0.07 0.07 - 0.06 - 0.04 Ybh-611-表三苯酚- - 0.87 0.43 - 0.26 Ybh-62正二十八烷0.05 0.07 0.03 1.06 1.22 0.49 Ybh-631,2,3,4,4a,7-六氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘0.02 0.04 0.04 - 0.02 0.02 Ybh-64香茅醇0.05 - - 0.10 - 0.03 Ybh-65α-可可烯- - 0.06 0.02 0.05 0.02 Ybh-66γ-馬阿里烯- 0.26 - - 0.04 0.06
3.2 圓柏不同基原藥材的化學計量學分析
3.2.1 PCA和PLS-DA分析 采用SIMCA-P軟件對所有揮發性成分（47個樣品×66個變量）進行無監督的PCA分析，繪制得分散點圖（圖1）。結果顯示，圓柏5個品種的分離效果不佳，大部分樣品重疊。為了突出種間差異，進一步進行有監督的PLS-DA分析。從PLS-DA得分圖（圖2）可知，高山柏和香柏與其它3個品種有較好的分離，而大果圓柏、滇藏方枝柏與祁連圓柏三者大部分樣品重疊，無法區分。這些結果表明，高山柏和香柏與其它3個品種的揮發性成分可能存在差異。此外，根據變量重要性圖(VIP)找出對組間差異貢獻較大的變量，并以VIP ＞ 1篩選不同基原圓柏藥材的主要差異成分，結果共找到32個潛在的種間差異成分，見圖3。
圖1 圓柏藥材的PCA得分圖Fig. 1 Score plot of PCA of Sabine Ramulus
圖2 圓柏藥材的PLS-DA得分圖Fig. 2 Score plot of PLS-DA of Sabine Ramulus
圖3 圓柏揮發性成分PLS-DA變量權重VIP圖Fig. 3 Variable importance plot of PLS-DA of Sabine Ramulus
3.2.2 方差分析 為驗證PLS-DA所獲取的分析結果，采用GraphPad Prism 5.0軟件對圓柏藥材的潛在種間差異成分、揮發油含量、種間差異成分的總含量進行單因素方差分析和Tukey’s多重比較檢驗，P＜ 0.05表示差異顯著。結果表明（圖4），圓柏不同品種間的揮發油含量不存在顯著性差異，但柳杉二醇、淚杉醇、2-十三烷酮等14個化合物在種間存在明顯的差異，為圓柏藥材的主要種間差異標志物（makers）。此外，本研究進一步以這14個makers的總含量為指標進行圓柏不同基原藥材的質量評價，結果表明，高山柏藥材的總含量最低，說明其藥材質量可能低于其它四種藥材。
圖4 圓柏種間差異成分、揮發油含量及種間差異成分總含量的方差分析結果（*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001）Fig. 4 Variance analysis results of the content of the different components,volatile oil and the total contents of the different components among species
本研究采用GC-MS技術從圓柏揮發性成分中共鑒定出66個化合物，其中欖香醇、柏木腦、γ桉葉醇、α-桉葉醇、淚杉醇、β-桉葉醇、十氫-2,7,3,6-二甲烷萘、δ-杜松烯、α-畢橙茄醇、13-表淚杉醇等為不同基原圓柏揮發油中共有且含量較高的成分。圓柏揮發性成分中富含萜類、倍半萜烯醇類化合物，提示其具有較強的抗菌作用[9]。現代研究發現，柏木腦[10-11]對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄桿菌、傷寒沙門氏菌、煙曲霉菌均有良好的抗菌活性。
此外，結合PCA、PLS-DA及方差分析，本研究首次揭示了圓柏不同品種之間揮發性成分的差異，最終確定淚杉醇、α-桉葉醇等14個化合物為圓柏藥材的種間差異成分。據研究報道，淚杉醇具有抗遺傳毒性、抗氧化等藥理作用[12-13]；
β-欖香烯及其衍生物具有抗腫瘤活性[14]，提示β-欖香烯含氧衍生物欖香醇可能具有抗腫瘤作用；
α-桉葉醇具有抗神經源性炎癥、抗腫瘤等作用[15-16]，對腦缺血損傷也具有保護作用[17]。這些化合物的生物活性與圓柏的功能主治有一定的相關性。因此，本研究進一步以這14個種間差異成分為指標對圓柏不同基原藥材進行質量評價，結果大果圓柏、香柏、滇藏方枝柏和祁連圓柏無明顯差異，但高山柏的質量可能較差，今后在臨床使用中應注意區分。本研究從揮發性成分的角度探討了圓柏不同基原藥材的質量差異，今后應結合藥理活性進行多維評價，從而為圓柏藥材的質量控制和臨床合理應用提供參考依據。