丁 豪,胡 凱,*,許 航,王 威,魏 磊,張 佩
(1.河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室,江蘇南京 210098;2.河海大學環境學院,江蘇南京 210098;3.河南省水文水資源局,河南鄭州 450004)
塑料污染問題日益嚴峻[1],尤其是顆粒尺寸小于5 mm的微塑料(microplastics,MPs)[2]。從赤道到兩極的海洋和沿海陸地均發現MPs污染[3-4],MPs可進入食物鏈并具有生物富集效應,MPs污染成為焦點[5-8]。
以生化技術為主的污水處理系統產生大量剩余污泥,厭氧消化是目前應用最廣的污泥穩定化處理技術[9-10]。研究[11-12]發現,部分MPs對消化系統具有明顯的抑制作用。例如,30粒/(g SS)的聚對苯二甲酸(PET)MPs可減少10%的甲烷產量,100～200粒/(g SS)的聚乙烯(PE)MPs抑制了27.5%的甲烷產量,投加0.2 g/L的聚苯乙烯(PS)MPs導致發酵系統啟動時間延長等[11]。同時,MPs對于微生物群落整體結構和多樣性影響較小,而對于單一功能細菌(如水解菌和產酸菌)豐度有顯著抑制[12]。上述研究主要針對原始MPs對厭氧發酵系統影響的問題,而MPs在污水處理過程中由于機械磨損以及光、熱、微生物等化學和生物的降解作用,會發生老化,引起理化性質較大改變。老化MPs可能對污泥厭氧發酵產生不同的影響,對比尚缺乏研究。
橡膠輪胎在汽車行駛過程中磨損產生的輪胎微塑料(TMPs)是水中MPs重要來源[13-14]。TMPs是我國排放數量最多的MPs種類(占總排放量的53.9%)[15],我國沿海省份橡膠輪胎微粒釋放量約為19萬t/a[16]。橡膠輪胎成分復雜,主要包括橡膠(質量分數為40%～50%,)、填充劑(質量分數為30%～35%)、柔軟劑(質量分數為10%)、硫化劑(質量分數為2%～5%)和添加劑(質量分數為5%～10%)等。因此,TMPs被檢出含有鋅、銅、多環芳烴、苯并噻唑等有毒物質,TMPs濃度較高時對生物體產生明顯的致畸性、致突變性等亞致死毒性效應[17]。雨水管網和受納水體均有檢出TMPs的報道,在合流制和分流制排水體制中,TMPs均可隨雨水進入管網和污水廠[18],TMPs對于污泥厭氧發酵系統的影響亟待揭示。綜上,原始MPs對污泥厭氧發酵產生影響,而排水管網和污水處理系統中的MPs經過環境老化過程,最終在剩余污泥中累積,因此,探究老化MPs對污泥厭氧發酵的影響具有重要意義。本文以TMPs為研究對象,采用化學法模擬環境老化過程,研究不同濃度的老化TMPs對剩余污泥厭氧發酵產酸過程影響,揭示老化TMPs的毒性效應和影響機理,為保障污泥處理工藝穩定運行提供技術支撐。
1.1 試驗材料
剩余污泥取自南京市某城市污水處理廠二沉池,經過濾去除大顆粒雜質,接著在4 ℃條件下重力濃縮6 h,用于厭氧發酵試驗,濃縮后污泥的理化性質如表1所示。
表1 試驗污泥的理化性質Tab.1 Physicochemical Properties of Test Sludge
TMPs購于陜西某橡膠制品廠,該廠以廢舊輪胎為原料,經破碎、分選和研磨粉碎等工序制成TMPs。試驗用的TMPs平均粒徑為107.7 μm。
1.2 試驗方案
1.2.1 TMPs老化
模擬MPs環境老化的過程主要采用酸、紫外或臭氧等物理化學方法。通過不同老化方法的對比研究[19-20]發現,強酸法在表面形態、元素和官能團組成等方面,對TMPs和PE等MPs都具有明顯的老化效果,適宜作為自然老化的替代方法。因此,本研究采用強酸浸泡法模擬TMPs在污水處理過程中的老化,具體步驟如下:取20.0 g TMPs于500 mL錐形瓶,加入1 mol/L的H2SO4溶液400 mL并混勻,在150 r/min振蕩條件下老化15 d。然后分別經過超純水清洗,0.45 μm微濾膜過濾,自然風干,對濾膜表面截留的老化TMPs顆粒進行掃描電鏡(SEM)和粒徑分布測試。
1.2.2 污泥厭氧發酵
采用4個體積為500 mL的血清瓶作為厭氧反應器,頂部安裝橡膠塞并插入塑料導氣管,導氣管另一端與集氣袋連接,收集產生的氣體。反應裝置如圖1所示。首先,每個反應器中加入400 mL剩余污泥,采用NaOH溶液調節pH值為10.0,將未投加MPs的反應器標記為AF-0,設置投加原始TMPs 0.2 g/(g VSS)的反應器為AF-1,根據不同質量分數[0.002、0.020、0.200 g/(g VSS)]投加定量的老化TMPs顆粒,反應器分別記為AF-2、AF-3、AF-4;接著,向反應器內通入氮氣以排除多余的空氣,并用橡膠塞密閉;最后,將反應器置于恒溫水浴振蕩器[水溫為(35±1)℃,振蕩速度為150 r/min]中厭氧發酵8 d。發酵期間每天取樣一次,每次樣品體積約為20 mL,樣品在5 000 r/min條件下離心10 min后,取離心上清液經0.45 μm濾膜過濾,測量樣品的揮發性有機酸(VFAs)、SCODCr、蛋白質、總糖、活性氧(ROS)等濃度以及微生物酶活性,每組樣品測試分析設置3個平行。
圖1 剩余污泥厭氧發酵產酸反應器Fig.1 Anaerobic Fermentation Reactor of Excess Sludge
1.2.3 TMPs浸出液
采用與發酵試驗相同的血清瓶作為反應器,投加與發酵試驗相同濃度的老化TMPs以及400 mL純水,反應器分別記為JC-1、JC-2和JC-3,然后在恒溫水浴振蕩器中振蕩8 d,水溫為(35±1)℃,振蕩速度為150 r/min。每天取樣一次,每次取樣50 mL,測量總有機碳(TOC)濃度,每組樣品測試分析設置3個平行。
1.3 分析方法
1.3.1 VFAs的測定
采用氣相色譜法(安捷倫7890B氣相色譜儀),載氣為氮氣,流速為25 mL/min,分流進樣(分流比為0.1∶1),進樣量為0.5 μL,單個樣品測試時間約為11 min。
1.3.2 酶活性和ROS測定
通過酶活性和ROS指標變化考察老化TMPs對污泥厭氧發酵酶和細胞活性的影響。取適量發酵污泥進行稀釋,采用試劑盒(南京建成)標準測試方法,使用Synergy H4型酶標儀測定蛋白酶、α-葡萄糖苷酶、乙酸激酶、乳酸脫氫酶(LDH)以及ROS含量。
1.3.3 其他檢測方法
pH、SCODCr、蛋白質、多糖、TOC等指標參照《水和廢水檢測分析方法》(第四版)。粒徑分析采用馬爾文2000激光粒度儀,SEM采用日立S-4800冷場發射掃描電子顯微鏡。
1.3.4 數據分析
采用Microsoft Excel 2010和Origin 2017對數據進行分析,使用IBM SPSS 26.0 軟件對皮爾遜相關系數和顯著性水平P值進行分析,若P<0.05認為差異性顯著。
圖2 不同老化TMPs濃度下污泥厭氧發酵系統pH值變化Fig.2 Variations of pH Values of Anaerobic Fermentation under Different Ageing TMPs Concentrations
2.1 老化TMPs對厭氧發酵產酸的影響
污泥厭氧發酵過程中,pH變化引起生物膜電位改變,影響酶活性和新陳代謝,進而影響發酵產酸性能[21]。通常,污泥厭氧發酵系統適宜pH值為6.5～7.2[22]。發酵過程中,各反應器的pH變化如圖2所示。系統初始pH值約為10.0,發酵前4 d,系統pH值快速降至6.6左右,5 d后污泥厭氧發酵系統pH值趨于穩定。這是因為發酵反應初期,VFAs的生成使系統迅速酸化,然后酸性物質產量下降,系統pH保持穩定。由圖2可知,AF-4反應器的pH在整個發酵過程中始終高于其他反應器,表明該反應器中酸性物質產量少于其他組。
圖3 不同濃度老化TMPs下厭氧發酵系統(a)產酸量和(b)VFAs組分變化Fig.3 Variations of (a) Acid Production and (b) VFAs Component in Anaerobic Fermentation under Different Ageing TMPs Concentrations
VFAs產量是評價發酵系統效能的重要參數[23]。不同老化TMPs濃度下,發酵系統VFAs產量如圖3(a)所示。各反應器VFAs濃度都隨著發酵時間的增加而升高;發酵前期VFAs濃度增長速率較快,5 d后增加增長速率減緩,濃度趨于穩定,上述變化趨勢與系統pH變化相似,可見發酵前期pH降低主要是由于產生的VFAs累積。圖3(a)中,AF-4反應器產酸量明顯低于其他反應器,在發酵第5 d時AF-4反應器產酸量僅為1 012.9 mg CODCr/L,約為其他反應器(AF-0、AF-1、AF-2、AF-3)產酸量的63.9%、65.5%、63.1%、66.0%,反應結束時產酸量僅為對照組AF-0和AF-1反應器的78.5%和81.2%。由此可見,高濃度[0.200 g/(g VSS)]的原始TMPs和低濃度[0.002、0.020 g/(g VSS)]老化TMPs對發酵系統未造成明顯的毒害作用,但高濃度[0.200 g/(g VSS)]的老化TMPs可明顯抑制發酵系統產酸過程。Wei等[12]發現低濃度PVC-MPs[10粒/(g SS)]可少量提高VFAs產量,但在高濃度時[20～60粒/(g SS)]顯著抑制,與TMPs表現一致。本研究中,在發酵前3 d內,所有反應器中MPs都未對系統造成明顯的抑制作用,在第2 d和第3 d時均觀察到原始TMPs和低濃度老化TMPs可少量促進產酸,可能是反應前期發酵底物充足、功能微生物活性較高所致。隨著發酵過程不斷進行,老化TMPs對發酵系統產酸的抑制逐漸顯現。
VFAs物質組成對于后續厭氧產甲烷具有重要影響,以乙酸為代表的VFAs也是生物合成甲烷的主要原料[24]。第8 d時6種主要的VFAs占比變化如圖3(b)所示。各組發酵液中乙酸和丙酸占VFAs總量的80.0%以上,其他4種揮發酸(異丁酸、正丁酸、異戊酸、和正戊酸)的占比相對較小且無明顯差異。5組反應器(AF-0、AF-1、AF-2、AF-3和AF-4)中,乙酸質量濃度分別為1 133.3、1 111.3、1 121.9、1 123.4 mg CODCr/L和970.5 mg CODCr/L,高濃度[0.2 g/(g VSS)]原始TMPs對乙酸產量無明顯影響,并且AF-4反應器的乙酸含量濃度與其他組差距較小。而5組反應器中乙酸占比分別為59.3%、60.17%、60.2%、62.2%和64.7%,丙酸占比分別為22.9%、20.51%、21.3%、18.2%和16.4%,可見隨著MPs濃度增加,乙酸占比增加,丙酸占比減小。已有研究[25]發現,投加Fe3O4可以促進厭氧發酵定向生產偶數碳VFAs(乙酸和丁酸)。與此類似,本研究中老化TMPs的存在可促進乙酸并抑制丙酸的產生,影響程度隨發酵系統老化TMPs濃度的增加呈現明顯的升高趨勢。因此,一方面,高濃度[0.200 g/(g VSS)]老化TMPs抑制系統中總VFAs產量,另一方面,高濃度老化TMPs中脅迫下的產酸微生物更能充分利用其他VFAs作為底物高效轉化為乙酸,從而減小與其他反應器的乙酸產量差距。由于上述兩種因素相互作用,老化TMPs可能對污泥厭氧發酵產乙酸過程抑制有限。
2.2 老化TMPs對厭氧發酵水解的影響
大分子有機物水解是污泥發酵的第一階段,SCODCr濃度是考察污泥水解效率的關鍵指標。圖4為不同老化TMPs濃度下發酵系統SCODCr濃度變化。各組反應器中SCODCr均隨發酵時間而增加,第8 d時,AF-0、AF-1、AF-2、AF-3和AF-4反應器中SCODCr質量濃度分別為2 903.3、2 808.7、2 823.1、2 662.7 mg/L和1 740.6 mg/L。整個發酵期間,投加MPs的反應器中SCODCr濃度始終低于對照組反應器,其中高濃度原始TMPs對SCODCr濃度抑制不顯著,而隨老化TMPs濃度增加,發酵液SCODCr呈現明顯下降的趨勢,例如第8 d時AF-4反應器SCODCr濃度較AF-0、AF-1、AF-2和AF-3反應器分別減少了40.0%、38.0%、38.3%和34.6%。可見,相比原始TMPs,老化TMPs可抑制與水解相關的微生物或生物酶活性。
圖4 不同濃度老化TMPs下發酵液SCODCr變化Fig.4 Variations of SCODCr under Different Ageing TMPs Concentrations
污泥發酵過程中,胞外聚合物(EPS)首先水解為蛋白質和多糖等有機物,這些可溶性有機物繼續水解生成VFAs,是VFAs的重要產生途徑[26]。圖5展示了在不同濃度老化TMPs影響下,發酵液中蛋白質和多糖濃度的變化。各反應器中蛋白質和多糖的濃度隨發酵時間不斷增加,并與SCODCr變化趨勢相同。第8 d時,AF-1反應器蛋白質和多糖含量為AF-0的93.5%和96.7%,高濃度[0.200 g/(g VSS)]的原始TMPs對微生物厭氧水解過程無明顯影響;但AF-4反應器蛋白質和多糖含量較AF-0降低21.5%和18.6%,表明高濃度老化MPs抑制了蛋白質和多糖的生成。Wei等[27]研究表明,投加高濃度[60粒/(g SS)]的PET會抑制厭氧發酵功能微生物對蛋白質和多糖的水解,并且產酸和產乙酰等生化反應過程也被抑制。結合2.1小節發酵液有機酸產量與乙酸占比的試驗結果,AF-4反應器VFAs產量較低的主要原因可能是厭氧發酵產酸底物的生成步驟被抑制,發酵液中可生物利用底物(蛋白質和多糖等)含量不足,將導致厭氧發酵產酸微生物活性降低從而削弱產酸效果[28]。
圖5 不同濃度老化TMPs下發酵液中(a)蛋白質和(b)多糖濃度Fig.5 Concentrations of (a)Protein and (b)Polysaccharide under Different Ageing TMPs Concentrations
2.3 老化TMPs對厭氧發酵酶活性和ROS的影響
微生物酶活性與發酵效果密切相關,蛋白酶和α-葡萄糖苷酶可將大分子蛋白和多糖水解為小分子氨基酸和葡萄糖,是污泥水解過程的兩種主要酶。如圖6所示,蛋白酶和α-葡萄糖苷酶的相對活性為AF-0>AF-2>AF-1>AF-3>AF-4,AF-4反應器中蛋白酶和α-葡萄糖苷酶的相對活性僅為AF-0反應器的86.3%和89.2%,表明老化TMPs抑制了發酵系統中水解酶的活性,使蛋白質和多糖的水解效率降低。同時,老化TMPs對于蛋白酶的抑制作用更強,這與發酵液中蛋白質和多糖的濃度試驗結果(圖5)一致。乙酸激酶可催化乙酰輔酶a生成乙酸,是乙酸生成途徑的關鍵控制酶,其活性決定乙酸的生成量。與水解酶的試驗結果相似,乙酸激酶活性隨著MPs濃度增加而減弱,AF-4反應器乙酸激酶活性僅為AF-0反應器的83.0%。綜上,老化TMPs通過抑制水解酶、產酸酶等功能酶活性從而抑制厭氧發酵過程。
圖6 不同濃度老化TMPs下厭氧發酵系統中酶相對活性和ROS水平Fig.6 Relative Enzyme Activities and ROS Levels in Anaerobic Fermentation under Different Ageing TMPs Concentrations
當細胞膜嚴重受損時,存在于細胞內的LDH被釋放到細胞外,因此,LDH是表征微生物細胞膜完整性的重要指標。由圖6可知,含有MPs的反應器中,LDH的釋放量為對照組的113.1%、115.8%、121.9%、124.5%,表明老化TMPs進入厭氧發酵系統,破壞微生物細胞完整性,導致部分厭氧發酵微生物死亡,細胞死亡后裂解,原本只存在于細胞內的LDH被釋放到細胞外,使得胞外LDH濃度增加,這與Zhang等[29]研究結論一致。
2.4 老化TMPs對厭氧發酵的影響機理
研究[34]表明,TMPs老化后理化性狀發生明顯變化,對環境行為產生較大影響。本文從表面形貌及化學物質溶出角度,闡述老化TMPs對發酵的影響機理。
2.4.1 老化TMPs的表面形貌變化
采用SEM觀察老化前后MPs表面細微結構的變化。如圖7所示,原始的TMPs顆粒完整,表面平滑且結構致密;酸老化15 d后,TMPs顆粒被破壞呈破碎狀,顆粒表面粗糙,孔隙率明顯增加。同時,老化后TMPs表面有較小的凸起結構并呈現脫落的趨勢,這是因為強酸進入TMPs顆粒,擴大了顆粒內部孔洞和縫隙等結構缺陷,從而造成TMPs表面物質逐層剝離脫落,內部結構破壞碎裂,整體呈現粉化狀態。同樣,研究人員[35]發現,橡膠態PE在老化后也出現了類似的層狀凸起和絮狀殘屑脫落現象。
圖7 老化前后TMPs表面形貌Fig.7 Variations of Surface Morphology of TMPs after Ageing
通過粒徑分布變化探討TMPs老化前后的顆粒粉化效果。如圖8所示,原始TMPs顆粒平均粒徑為107.7 μm,酸老化后平均粒徑降為70.9 μm,減小了約34.2%。
上述結果表明,強酸對TMPs顆粒表面造成明顯的破壞,碎裂為粒徑更小的顆粒,試驗觀察到酸老化后最小粒徑約為2 μm。研究[36-37]表明,微米級別的MPs顆粒可穿透EPS,聚集在細胞膜上造成細胞膜損傷,影響膜蛋白活性和營養物質傳遞等細胞新陳代謝功能;納米級別的MPs顆粒可進入細胞膜,改變膜結構,顯著影響分子擴散過程,進而影響細胞活性。可見,MPs粒徑越小(例如老化TMPs顆粒),對微生物影響越大,并且小粒徑MPs濃度越高,對污泥厭氧發酵系統的影響越大。因此,老化TMPs顆粒結構被破壞和粉化現象是抑制污泥發酵系統的重要原因。
圖8 老化前后TMPs顆粒粒徑分布Fig.8 Variations of Original and Ageing TMPs Particle Size Distributions
2.4.2 老化TMPs中有毒物質的溶出
MPs在水中可浸出塑料單體和添加劑等有毒物,例如聚氯乙烯(PVC)浸出液含有添加劑雙酚A(BPA),對厭氧消化產甲烷階段具有明顯抑制[12]。輪胎制造時加入抗老化劑、硫化劑和活性劑等添加劑以改善產品性能,這些添加劑通常具有生物毒性[38]。圖9～圖10為不同濃度的老化TMPs浸出液中TOC濃度和三維熒光光譜。由圖9可知,隨著老化TMPs濃度增加,浸出液TOC濃度上升,第8 d時JC-3反應器TOC濃度較JC-1和JC-2反應器分別提高37.3%和30.4%,這與不同濃度老化TMPs對污泥發酵系統的抑制強弱順序一致;此外,老化TMPs有機物浸出速率較快,第1 d浸出量可達總量85%左右,這意味著浸出物對于發酵系統的影響貫穿整個發酵過程,并且可能存在毒性累積效應。Capolupo等[39]研究表明,對于藻類和貽貝,TMPs浸出液中有機物含量較高,導致TMPs浸出液毒性大于其他種類MPs的浸出液。三維熒光光譜能特異性識別有機物,被廣泛運用于溶解性有機物的檢測。由圖9可知,反應器JC-3浸出液在激發波長Ex為230 nm左右、發射波長Em為350 nm左右有明顯吸收峰,并且吸收峰強度隨老化TMPs濃度增加而增加。這些物質主要是由苯丙烷衍生物形成的苯丙素類化合物[40]。研究[41]發現,TMPs浸出液含有苯丙噻唑、多環芳烴和多種揮發性有機物,其中,苯丙噻唑和多環芳烴具有較高生物毒性。老化TMPs浸出苯并噻唑等毒性有機物也成為抑制污泥發酵系統的原因之一。
綜上,老化TMPs影響污泥厭氧發酵的機理如圖11所示。(1)老化TMPs的直接作用。納米級別的老化TMPs能附著細菌細胞壁上產生凹陷和納米孔,造成細胞膜通透性,并且在進入細胞后改變細胞內氧化還原循環和破壞細胞結構,造成微生物死亡。(2)老化TMPs的間接作用。在發酵系統中,苯丙噻唑等有毒有機物持續從老化TMPs浸出,影響細胞酶的活性;同時有毒物質與老化TMPs顆粒在細胞中會誘導產生的ROS,產生氧化應激效應,從而抑制厭氧發酵產酸。
圖10 老化TMPs浸出液三維熒光光譜Fig.10 3D Fluorescence Spectrum of Ageing TMPs Leachate
圖11 老化TMPs對發酵微生物的影響機理Fig.11 Mechanism of Influence of Ageing TMPs on Fermentation Microorganisms
本文探討了老化TMPs對剩余污泥厭氧發酵產酸的影響,并從酶活性、顆粒表面形貌和有機物浸出等角度探究了老化TMPs的影響機理。得出結論如下。
(1)老化TMPs抑制污泥發酵產酸和厭氧水解過程,并且抑制程度隨老化TMPs濃度增加而增強。老化TMPs可能通過抑制大分子有機物水解步驟從而抑制發酵產酸效果。
(2)污泥發酵功能酶(蛋白酶、α-葡萄糖苷酶和乙酸激酶)相對活性隨系統中老化TMPs濃度增加而減弱,LDH和ROS的變化趨勢則相反。
(3)老化TMPs的致毒機理包括老化后TMPs顆粒物理結構被破壞,粒徑減小,同時浸出有毒有機物,造成微生物氧化應激反應,細胞酶活性被抑制。
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