晉 彪張 靜洪坤強王智文陳 濤?
嗜鹽微生物(Halophiles)是六大極端微生物的一種[1],其正常的生長需要較高的鹽濃度來維持。相比于其他常見底盤微生物,嗜鹽菌的高耐鹽特性使其在培養過程中不易染菌,可以進行不嚴格的滅菌發酵[2],下游提取胞內PHB 產物時,加入適量清水即可實現細胞破壁,在節約能耗的同時,也簡化了發酵工藝。
但嗜鹽微生物的遺傳背景不清晰、基因編輯難度大制約了其發展。
自**艾丁湖分離純化得到的嗜鹽菌TD01(Halomonassp. TD01),最適生長溫度37 ℃,最適生長鹽濃度為60 g·L-1NaCl,最高可耐受250 g·L-1NaCl,是1 株中度嗜鹽菌并可天然生產聚3-羥基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)[3]。
CRISPR/Cas9 基因編輯系統[4]、組成型啟動子庫PPorin[5]、誘導型表達系統[6]等基因編輯手段在Halomonassp. TD01 中的成功應用,為其作為下一代工業生物技術的底盤細胞打下堅實基礎。
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是一類由含羥基脂肪酸單體聚合而成的生物大分子聚合物,無毒無害可再生,具有生物相容性、可降解性和良好的物化特性[7],在生物塑料[8]、藥物緩釋載體、植入性材料[9]等領域擁有廣泛前景[10]。
聚3-羥基丁酸酯由3-羥基丁酸聚合而成,是結構最簡單,研究最清楚的PHA。
乙酸作為一種二元弱酸,不僅常作為生物發酵時產生的副產物,還廣泛存在于各種纖維素水解液中[11]。
乙酸鈉的價格比葡萄糖每噸低150 美元左右[12],研究表明,利用廉價的乙酸鹽代替葡萄糖進行如異丙醇[13]、乙醇酸[14]等高附加值產品的生產是具有一定潛力的。
但高濃度的乙酸根和鹽離子會抑制菌體生長,降低產量和產率,因此提高工程菌株對乙酸鹽的耐受和利用效率至關重要。
本研究測試發現Halomonassp. TD1.0 具有天然耐受高濃度乙酸鈉的優勢,并可利用乙酸高效合成PHB。
隨后我們通過過表達枯草芽孢桿菌來源的乙酰輔酶A 合成酶(ACS)進一步提高了菌株的乙酸利用速度和PHB 產量,并初步研究了ACS 的表達對TD1.0 利用葡萄糖和乙酸鈉混合碳源進行代謝的影響。
1.1 菌株和質粒
菌株和質粒見表1。
表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study
1.2 培養基
LB 培養基:5 g·L-1酵母抽提物,10 g·L-1胰蛋白胨,10 g·L-1氯化鈉,pH=7.0。
需要時額外添30 μg·mL-1相應抗生素。
固體培養基添加2%的瓊脂。
20LB 培養基:LB 培養基的基礎上把氯化鈉濃度提到20 g·L-1。
60LB 培養基:LB 培養基的基礎上把氯化鈉濃度提到60 g·L-1,pH 值調至9.0。
60MMG 發酵培養基:60 g·L-1NaCl,1 g·L-1酵母抽提物,20 g·L-1葡萄糖或27.3 g·L-1NaAC,9.85 g·L-1Na2HPO4·12H2O,1.5 g·L-1KH2PO4,1 g·L-1NH4Cl,0.4 g·L-1MgSO4·7H2O,0.05 g·L-1Fe(Ⅲ)-NH4-Citrate,0.02 g·L-1CaCl2·2H2O,0.1 mg·L-1Zn-SO4·7H2O,0.03 mg·L-1MnCl2·4H2O,0.3 mg·L-1H3BO3,0.2 mg·L-1CoCl2·6H2O,0.01 mg·L-1CuSO4·5H2O,0.02 mg·L-1NiCl2·6H2O,0.03 mg·L-1NaMoO4·2H2O。
1.3 引物設計
引物設計見表2。
表2 引物設計Table 2 Primers used in this study
1.4 質粒的構建
一般高拷貝表達質粒的構建:將枯草芽孢桿菌屬來源的acs基因序列,根據嗜鹽單胞菌的密碼子偏愛性進行優化,并由蘇州金唯智生物科技有限公司進行基因合成,合成的acs基因連接至pU17 獲得pU17-acs。
以 pU17-acs為模板, 采用引物 ACSPN59-M-F 和ACS-PN59-M-R,PCR 擴增得到acs 片段(引物2 端分別帶有與質粒骨架有互補的25 bp序列)。
以攜帶誘導型啟動子PMmp1的高拷貝質粒pN59-pSEVA341[16]為模板,采用引物PN59-M-ACSF 和PN59-M-ACS-R,PCR 擴增得到質粒骨架(2 端有25bp 與ACS 互補的序列)。
將得到的目標片段和質粒骨架,采用Gibson 組裝試劑盒(NEB 公司),進行無縫融合。
誘導型低拷貝穿梭質粒pN85-pSEVA321[17]以同樣的方法進行構建,基因acs的擴增引物采用ACS-PN85-M-F 和ACS-PN85-M-R,質粒pN85-pSEVA341 的擴增引物采用PN85-M-ACS-F 和PN85-M-ACS-R。
1.5 接合轉化的方法
E. coliDH5α 的化轉和E. coliS17-1 的電轉方法參照Ma 等[17]方法。
接合轉化方法同Ye 等[18]。最終接合菌體用無抗60LB 重懸菌體后涂布到加有30 μg·mL-1氯霉素抗性的 60LB 平板上,37 ℃培養48 h,獲的單菌落進行菌落PCR 驗證得到正確的轉化菌株。
1.6 提取總蛋白
取適量菌液,離心去上清,洗滌2 次,100 ℃煮10 min,離心取上清,進行SDS-PAGE 分析。
1.7 搖瓶發酵
將菌株在60LB 平板上劃線,37 ℃培養24 h,挑取單菌落接種至60LB,37 ℃,220 r·min-1下培養12 h,連續活化2 次。
最后將二級活化種子液接種到60 MMG(Glu/NaAC)發酵培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)中,接種量為0.25(OD600),需要時添加30 μg·mL-1氯霉素抗性,和1 mmol·L-1誘導物IPTG(OD600為0.4～0.6 時添加),在37 ℃,220 r·min-1條件下進行發酵培養。
1.8 發酵液分析與產物測定
細胞OD600值使用紫外可見分光光度計測定。葡萄糖和乙酸鈉濃度使用高效液相色譜儀進行檢測,色譜柱型號HPX87H-安捷倫,流動相為5 mmol·L-1H2SO4,流速0.5 mL·min-1,柱溫60 ℃,檢測器為示差 RID 檢測器。
細胞干質量測量:取適量發酵菌體,離心去上清,- 80 ℃超低溫冰箱內冷凍12 h,采用德國CHRIST 公司的冷凍干燥機凍干12 h,精密電子天平測量細胞干質量。
PHB 產物分析:稱取20 mg 左右干菌體和適量PHB 標品,置于耐高溫封閉性好的酯化管中,加入1.5 mL 酯化液(485 mL 甲醇,15 mL 濃硫酸,0.25 g苯甲酸)和1.5 mL 三氯甲烷,100 ℃酯化4 h。
向酯化后的體系中加入1 mL 雙蒸水,震蕩混勻,靜置分層,取下層有機相用于氣相色譜的檢測。
色譜條件為:N2載氣,H2燃燒氣體,流速30 mL·min-1,空氣400 mL·min-1,柱子為安捷倫HP-5,氣相程序:進樣口溫度240 ℃,檢測器溫度250 ℃,初始溫度80 ℃,維持1.5 min,30 ℃·min-1升溫至140 ℃,40 ℃·min-1升溫至240 ℃,維持2 min。
2.1 TD1.0 對乙酸鈉的利用和耐受性測試
為表征嗜鹽單胞菌TD1.0 對乙酸鈉的利用和耐受能力,60 MMG 為基礎培養基,以25、50、75、100 g·L-1的乙酸鈉代替葡萄糖為碳源進行生長測試。
菌株在不同濃度乙酸鈉為碳源條件下的生長曲線見圖1。
圖1 NaAC 耐受測試Fig.1 Tolerance of NaAC
由圖1 可知,TD1.0 在高濃度乙酸鈉(25 ～100 g·L-1)的碳源下均可以生長,其中在25 g·L-1乙酸鈉為碳源下長勢最好,最高生物量達到了16.8(OD600)。
但隨著乙酸鈉濃度的提高,菌株生長受到了抑制,濃度越高,抑制程度越明顯。
在生長前期(12 h 內),100 g·L-1乙酸鈉條件下,培養12 h OD600僅從0.25 長到0.87,而此時以25 g·L-1乙酸鈉為碳源的菌株OD600已經達到了5.48。
培養72 h,TD1.0 在100 g·L-1NaAC 中最大OD600為9.1,相比于在25 g·L-1乙酸鈉實驗組,其生長抑制率達到45.8%,而大多數微生物在乙酸鹽濃度超過 0.5 g·L-1時,其生長就會受到嚴重抑制[19]。
以上結果表明嗜鹽單胞菌TD1.0 具有天然的利用和耐受高濃度乙酸鈉的生理優勢,為后續開發嗜鹽單胞菌利用廉價的乙酸鹽代替葡萄糖生產相關化學品具有巨大潛力。
2.2 過表達ACS 對乙酸利用和PHB 合成的影響
在嗜鹽菌中,以葡萄糖和乙酸鈉為碳源合成PHB 的途徑如圖2 所示。
葡萄糖經過糖酵解途徑轉化為乙酰輔酶A,乙酸鈉經過乙酰-CoA 合成酶(ACS)得到乙酰輔酶A,其中一部分乙酰-CoA 進入TCA 循環,另一部分在乙酰-CoA 乙酰基轉移酶(PhaA)的作用下生成乙酰乙酰-CoA,繼而在3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶(PhaB)的作用下生成3-羥基丁酰-CoA,最終在聚羥基脂肪酸酯合成酶(PhaC)的作用下生成聚3-羥基脂肪酸酯(PHB)。
圖2 PHB 的生產途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of PHB
為進一步強化嗜鹽單胞菌利用乙酸鈉的優勢,本實驗構建了以高拷貝acs表達載體pN59-M-ACS和低拷貝acs表達載體pN85-M-ACS。
通過接合轉化將2 種質粒分別導入TD1.0 后得到菌株TDPN59 和TD-PN85,SDS-PAGE 分析的ACS 蛋白表達見圖3,TD-PN59 和TD-PN85 中ACS 蛋白(65 kDa)均可正常表達,且高拷貝表達菌株TD-PN59 的ACS蛋白條帶較TD-PN85 更為明顯,表明表達載體拷貝數越高,ACS 的表達量就越多。
圖3 菌株TD-PN59 和TD-PN85 胞內ACS 的PAGE 檢測Fig.3 ACS expression in strain TD-PN59 and TD-PN85
進一步對TD-PN59 和TD-PN85 進行乙酸鈉為單一碳源搖瓶生長測試,其中乙酸鈉濃度為27.3 g·L-1為碳源,對照組以20 g·L-1葡萄糖(碳物質的量等價于27.3 g·L-1乙酸鈉)為單一碳源。
以TD1.0 為對照菌株,以初始OD600=0.25 進行接種,其中TD-PN59和TD-PN85 菌株在OD600長至0.4 ～ 0.6 時添加1 mmol·L-1的IPTG 誘導ACS 表達。
37 ℃,200 r·min-1培養,間隔取樣測定碳源剩余量、生物量(OD600)(圖4)和胞內PHB 產量(圖5)。
圖4 導入不同拷貝數ACS 菌株的生長情況Fig.4 Growing status of different strains
圖5 導入不同拷貝數ACS 菌株的CDW 和PHB 產量Fig.5 CDW and PHB content of different strains
由圖4 和圖5 可知,TD1.0 菌株以葡萄糖為碳源時,前期生長階段(<12 h),生長迅速,優于乙酸鈉,最高 OD600為26;以乙酸鈉為碳源雖前期生長速度慢于葡萄糖,但培養12 h 后,乙酸鈉利用加快,最大值達到30.57(OD600),優于葡萄糖為碳源的生長(圖4)。
代謝葡萄糖的對照組pH 值從最初的9.0降到了6.3,代謝乙酸鈉的實驗組pH 值仍維持在9.0 左右,這說明代謝葡萄糖會產生大量的酸性代謝副產物,對菌株生長產生抑制作用[20],而代謝乙酸鈉時能維持堿性環境從而有利于細胞在發酵后期的生長。
TD1.0 以葡萄糖為碳源在42 h 達到最大細胞干質量(CDW),為9.87 g·L-1,PHB 產量為6.12 g·L-1,PHB 胞內產物占比0.62 g/g(PHB/干菌體)。
以乙酸鈉為碳源時,TD1.0 可在36 h 內完全消耗完乙酸鈉,并在48 h 時達到9.6 g·L-1的最大細胞干質量,PHB 產量和胞內質量分數分別為5.86 g·L-1和61%。
含高拷貝質粒pN59-M-ACS 的菌株TD-PN59約30 h 消耗完乙酸鈉,并在36 h 時達到31.5 的最大細胞OD600值,發酵過程中的最大和平均乙酸鹽利用速率為1.47 (9～12 h)和 0.91 g·L-1·h-1,比TD1.0 分別提高 37.4%[1.07 g·L-1·h-1(9～12 h)]和19.7%(0.76 g·L-1·h-1)。
菌株TD-PN59 的細胞干質量也有輕微提升,發酵42 h 時達到9.98 g·L-1,PHB 的產量和胞內含量分別為6.49 g·L-1和65%,PHB 產量相比于TD1.0 利用乙酸鈉為碳源提高(5.86 g·L-1)了約11%,比TD1.0 利用葡萄糖為碳源(6.12 g·L-1)提高了約6%。
含低拷貝質粒pN85-M-ACS 的菌株TD-PN85 在42 h 時達到最大細胞OD600值(30.24),其最大乙酸鈉利用速率為1.20 g·L-1·h-1(9～12 h),相比于野生型提高了12%,但平均乙酸鈉利用速率未見明顯提升。
TD-PN85 利用乙酸鈉時的PHB 產量為6.01 g·L-1,此時細胞干質量為9.7 g·L-1,PHB 含量為62%。
20 g·L-1的葡萄糖和27.3 g·L-1的乙酸鈉含有相同的碳摩爾數(約0.667 mol·L-1)。
當菌株TD1.0 以葡萄糖為底物時,其合成PHB 的碳摩爾轉化率為42.7% C-mol;以乙酸鈉為底物時的PHB 碳摩爾轉化率為40.9% C-mol;工程菌TD-PN59 以乙酸鈉為底物時合成PHB 的碳摩爾轉化率為45.3%C-mol,相比于TD1.0 利用葡萄糖或乙酸鈉時分別提升了6.1%和10.8%。
上述結果表明,以廉價乙酸鹽替代葡萄糖進行發酵生產PHB 是可行的,并且通過過表達ACS,不僅可以提高TD1.0 的乙酸鈉利用速率,還可提高細胞干質量和PHB 的產量。
葡萄糖需要經過整個EMP 途徑代謝后才能轉化為PHB 的前體物乙酰輔酶A,而乙酸進入細胞后僅需一步反應就可轉化為乙酰輔酶A(圖2),因此以乙酸為碳源合成PHB 時在乙酰輔酶A 供應方面具有獨特的優勢。
除了過表達ACS 之外,在后續的工作中還可以通過激活乙醛酸循環[21]和實驗室適應性進化[22]等策略提進一步提高乙酸鹽的利用效率。
2.3 葡萄糖與乙酸鈉混合碳源發酵
隨后考察了ACS 表達對菌株代謝葡萄糖和乙酸鈉混合碳源(60 MMG,10 g·L-1葡萄糖和10 g·L-1乙酸鈉)的影響,結果如圖6 所示。
圖6 混合碳源條件下菌株碳源消耗和生長曲線Fig.6 OD600 and the consistence of Glu/NaAC
TD1.0 在代謝葡萄糖和乙酸鈉混合碳源時表現出明顯的代謝物阻遏效應[23],即先利用葡萄糖后利用乙酸鈉的特征,由于生長前期只快速利用葡萄糖而造成代謝溢流現象,生成了乙酸副產物而使得培養基中乙酸鈉含量略有上升(最高至10.52 g·L-1),待葡萄糖濃度較低(<4 g·L-1)時,逐漸開始利用乙酸鈉,最終在28 h 時完全消耗完2 種碳源。
與野生型TD1.0 相比,過表達ACS 的菌株TD-PN85 在生長前期葡萄糖利用較緩,但卻具有明顯的葡萄糖和乙酸鈉共利用的特征,且沒有發現培養基中因利用葡萄糖而導致乙酸增加的現象,說明表達ACS 后導致乙酸利用效率提升而快速消耗掉葡萄糖產生的乙酸,最終在培養26 h 時能夠完全消耗完2 種碳源,最大細胞OD 為39.68,高于TD1.0(35.62)。
在整個發酵過程中,TD-PN85 菌株雙碳源共利用的最大速率為1.63 g·L-1·h-1(12 ～ 14 h),比TD1.0(1.08 g·L-1·h-1,6～8 h)提高了約51%。
同樣地,我們也進行了TD-PN59 的混合碳源生長實驗,但因為拷貝數過高,給菌株帶來了巨大的代謝負擔,延緩了菌株生長,葡萄糖和乙酸利用速率均大幅降低。
由圖7 可知,菌株TD-PN85 的CDW 和PHB 產量均略高于對照菌株TD1.0。
在34 h 時,對照菌株TD1.0 利用混糖取得最大CDW 為7.82 g·L-1,PHB產量為4.22 g·L-1,含量為54%。
菌株TD-PN85 同樣在34 h 時取得最大CDW 為7.91 g·L-1,PHB 產量為4.43 g·L-1,含量為56%,相比于對照菌株均稍有提升。
與單一碳源相比,2 個菌株在利用葡萄糖/乙酸鈉混合碳源時的PHB 碳摩爾轉化率均顯著下降(約為35% C-mol),這很可能是因為等量配比的葡萄糖和乙酸鈉造成了比較顯著的代謝模式轉換,從而影響到PHB 的合成效率,后續研究中需要進一步優化2 種碳源的比例或添加方式以提高PHB 的合成。
圖7 混合碳源條件下菌株CDW 和PHB 產量Fig.7 CDW and PHB from Glu/NaAC
實驗表明,在嗜鹽菌TD1.0 中,采用質粒pN85-M-ACS 過表達ACS 可以有效緩解葡萄糖代謝物阻遏效應,促進葡萄糖和乙酸鈉的共利用,但PHB 產量并沒有得到顯著提高。
1)嗜鹽單胞菌Halomonassp.TD1.0 可耐受高濃度乙酸鈉,乙酸鈉濃度從25 g·L-1提高至100 g·L-1時對其生長抑制程度只有45.8%,其乙酸鈉耐受性顯著優于大腸桿菌等普通模式菌株,并可利用乙酸鈉為單一碳源高效合成PHB。
2)在嗜鹽單胞菌TD1.0 中表達異源乙酰輔酶A 合成酶后的工程菌TD-PN59 的乙酸鹽平均利用速度提高了19.7%,并且其細胞干質量、PHB 產量和PHB 胞內質量分數分別達到9.98 g·L-1,6.49 g·L-1和65%,分別比同樣培養條件下的野生型菌株提高了3.2%,10.8%,和 7.3%。
3)低拷貝量表達acs可以顯著緩解葡萄糖對乙酸鈉的分解代謝物阻遏效應實現葡萄糖和乙酸鈉的共利用。
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