董 萌，施龍清，解振興，連 玲，吳春珠，張居念，張數(shù)標(biāo)，姜照偉
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，福建 福州 350018)
氮素是水稻生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)元素，影響水稻的分蘗與穗質(zhì)量，進(jìn)而影響水稻產(chǎn)量，對(duì)水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)有重要意義。我國(guó)水稻生產(chǎn)中，為保證產(chǎn)量而投入過(guò)多氮肥，導(dǎo)致氮肥利用率降低。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，水稻根系有大量微生物，其對(duì)提高水稻的氮肥利用效率具有重要作用[1-2]。在自然界中，生物固氮主要有自生固氮、共生固氮和聯(lián)合固氮3種方式，禾本科作物以聯(lián)合固氮菌為主。聯(lián)合固氮菌不僅能為宿主提供氮素，同時(shí)具有溶磷、增強(qiáng)宿主抗性、促進(jìn)宿主生長(zhǎng)發(fā)育的作用。
20世紀(jì)60年代，內(nèi)生固氮菌首次在甘蔗中被發(fā)現(xiàn)，之后在不同禾本科作物中均有發(fā)現(xiàn)[3]。研究者利用PCR擴(kuò)增方法，從日本水稻品種Nihonn的根系中檢測(cè)到23個(gè)含固氮酶鐵蛋白基因(nifH)序列的內(nèi)生菌，其中Δ-變形菌(脫硫弧菌屬)和γ-變形菌(類克雷伯氏菌屬)是主要內(nèi)生固氮菌[3]。Zhang等[2]對(duì)68份秈稻和27份粳稻根系微生物的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，秈稻能特異富集與氮代謝相關(guān)的微生物，說(shuō)明根系微生物群落可能會(huì)導(dǎo)致秈稻和粳稻氮素利用效率不同。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NRT1.1B)是秈稻氮利用效率高于粳稻的原因之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期、不同地點(diǎn)的水稻根系微生群屬不同[5-7]。水稻根系中的內(nèi)生固氮菌可以產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)，IAA可促進(jìn)根系生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)水稻根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[8-9]。國(guó)內(nèi)外研究人員從水稻根系中分離到許多內(nèi)生固氮菌，但對(duì)不同生育期水稻根系內(nèi)生固氮菌的多樣性及其對(duì)水稻根系生長(zhǎng)和氮素吸收利用影響的研究較少。探究不同生育期水稻根系內(nèi)生固氮菌的多樣性，可以揭示內(nèi)生固氮菌在水稻體內(nèi)的變化規(guī)律，為固氮菌在水稻生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)以水稻品種佳輻占為材料，在拔節(jié)期和抽穗期對(duì)其根系內(nèi)生固氮菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)分離菌的溶磷能力、固氮酶活性和促生能力進(jìn)行檢測(cè)，旨在為水稻微生物肥料的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
1.1 材 料
水稻品種佳輻占、日本晴、臺(tái)粳8號(hào)，由本課題組提供。Ashby液體培養(yǎng)基和Ashby無(wú)氮固體培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物。PCR反應(yīng)所需試劑，均購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)；
膠回收試劑盒，購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司。無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，硫酸銨0.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸錳0.03 g/L，硫酸鉀0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，磷酸鈣5.0 g/L，瓊脂15 g/L。有機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，硫酸銨0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，硫酸錳0.03 g/L，卵磷脂0.2 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，瓊脂15 g/L。解鉀培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，磷酸鈉0.2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，氯化鈉0.2 g/L，二水硫酸鈣0.2 g/L，碳酸鈣5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，鉀長(zhǎng)石粉(直徑<74 μm) 2.5 g/L。
1.2 根系內(nèi)生固氮菌株的分離
用于分離內(nèi)生固氮菌的水稻品種為佳輻占，種植地點(diǎn)為福州市福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所農(nóng)場(chǎng)(119°21′57″E,26°00′53″N)。2019年3月15日育秧，4月19日采用人工插秧方式移栽。供試土壤類型為砂質(zhì)壤土，試驗(yàn)前土壤有機(jī)質(zhì)、全氮含量分別為20.1和1.8 g/kg，速效氮、速效磷和速效鉀含量分別為144.91，31.72和188.17 mg/kg。氮肥(N)施用量為180 kg/hm2，施用比例為m(基肥)∶m(分蘗肥)∶m(促花肥)∶m(?；ǚ?=3∶4∶2∶1。在佳輻占拔節(jié)期(6月上旬)和抽穗期(6月下旬)各選5株水稻，取其根系(地下10 cm)用流水沖洗表面泥土，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡10 min，然后用無(wú)菌水洗滌5次，放入20 g/L的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，無(wú)菌水沖洗4～6次。將消毒后的水稻根置于含Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基的平板內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)2 d，若平板中無(wú)菌生長(zhǎng)說(shuō)明根表面消毒徹底，否則需要重新消毒。將表面消毒完全的根置于加有8 mL Ashby液體培養(yǎng)基的滅菌研缽內(nèi)磨碎，靜置5 min后，取5 mL上清液加入到20 mL Ashby液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d，隨后轉(zhuǎn)接到新的Ashby液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3次，然后在Ashby無(wú)氮固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離，直至出現(xiàn)單克隆菌落，挑取單克隆于2 mL無(wú)菌離心管中，加入1 mL Ashby液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d，最后在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離，挑取不同形態(tài)菌落純化培養(yǎng)并保存菌種。
1.3 根系內(nèi)生固氮菌的鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析
在細(xì)菌編碼rRNA操縱子的5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA中，16S rRNA是最穩(wěn)定保守的，常用于細(xì)菌的分類鑒定。合成16S rRNA基因引物：F27:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，R1514:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。采用PCR方法對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，PCR 反應(yīng)體系(50 μL)為：5×Primer STAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，F(xiàn)27引物1 μL，R1514引物 1 μL，Template(菌液) 1 μL，PrimerSTAR GXL DNA Polymerase 2 μL，滅菌水31 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃ 1 min；
98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，送上海生工生物股份有限公司測(cè)序。用NCBI blast對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)定Bootstrap為1 000。
1.4 根系內(nèi)生固氮菌溶磷解鉀能力測(cè)定
將分離的內(nèi)生固氮菌菌株活化，吸取10 μL菌液置于無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基、有機(jī)磷固體培養(yǎng)基和解鉀培養(yǎng)基的平板中間，30 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察有無(wú)透明圈生成，重復(fù)3次。
1.5 根系內(nèi)生固氮菌固氮酶活性檢測(cè)
利用乙炔還原法檢測(cè)內(nèi)生固氮菌株的固氮酶活性。取5 mL活化后的菌液接種于Ashby液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2～4 d至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取5 mL新鮮菌液至頂空瓶中(已滅菌)并壓蓋封口。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)遠(yuǎn)離火源處抽取1 mL氣體然后再注入1 mL標(biāo)準(zhǔn)乙炔氣體，30 ℃培養(yǎng)48 h后，80～100 ℃水浴5～10 min，用氣相色譜儀檢測(cè)生成乙烯體積分?jǐn)?shù)。固氮酶活性以每單位樣品每小時(shí)生成乙烯的物質(zhì)的量表示，計(jì)算公式如下：
固氮酶活性(nmol/(mL·h))=(生成乙烯濃度(μL/mL)×氣體體積(mL)×稀釋倍數(shù)×1 000)/(樣品體積(mL)×反應(yīng)時(shí)間(h)×24.5) 。
1.6 根系內(nèi)生固氮菌促生能力檢測(cè)
1.6.1 盆栽接種試驗(yàn) 供試侵染水稻品種為日本晴，接種菌株為J3、J10、J23、H27、H30、H33、H37、H40-2，按照文獻(xiàn)[2]中的方法進(jìn)行接種。具體操作如下：將水稻土裝入培養(yǎng)盆中，用密封袋封裝后置于60Co-γ輻照裝置中滅菌，輻照劑量為40 kGy(2 kGy/h，持續(xù)20 h)。去掉水稻種子谷殼，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇表面滅菌1 min，然后再用10 g/L次氯酸鈉滅菌8 min，無(wú)菌水洗滌3～5次，在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d。將菌株J3、J10、J23、H27、H30、H33、H37、H40-2分別用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至菌液OD600約為0.8，收集菌液并調(diào)整其OD600為0.5，備用。取2.0 mL混合菌液添加到250 mL無(wú)菌水中，并與培養(yǎng)盆中土壤(約200 g)混合，對(duì)照用無(wú)菌水替代。將5日齡的水稻苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)盆中，在28 ℃、16 h光照和相對(duì)濕度40%條件下培養(yǎng)，2周后測(cè)量株高、地上部分鮮質(zhì)量和根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量，評(píng)估菌株對(duì)水稻的促生作用。
1.6.2 田間接種試驗(yàn) 供試侵染水稻品種為佳輻占和臺(tái)粳8號(hào)，種植地點(diǎn)在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所農(nóng)場(chǎng)，2021年3月中旬育秧，30 d后插秧。將6株內(nèi)生固氮菌株(J3、J23、H27、H33、H37、H40-2)分別培養(yǎng)至菌液OD600為0.5～0.6，收集菌液并用PBS (0.1 mmol/L,pH=7.2)緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)菌含量至108CFU/mL，等體積混合，備用。將混合菌液侵染水稻佳輻占、臺(tái)粳8號(hào)幼苗根部，15 min后移栽，對(duì)照組用緩沖液PBS浸泡根部，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，水肥管理(除基肥外)按照2019年施肥方式減半。在水稻齊穗期，每小區(qū)選取10株水稻測(cè)定頂上3片葉(倒1葉、倒2葉和倒3葉)的SPAD值。
2.1 水稻根系內(nèi)生固氮菌的分離純化
在水稻拔節(jié)期共分離得到10株固氮菌，分屬于5個(gè)科，其中腸桿菌科4株，假單胞菌科和莫拉菌科各2株，叢毛單胞菌科和柄桿菌科各1株(表1)。在水稻抽穗期分離到內(nèi)生固氮菌20株，除1株科未定外，其余19株分屬于8個(gè)科，其中假單胞菌科7株，氣單胞菌科5株，腸桿菌科2株，叢毛單胞菌科、鞘脂單胞菌科、李斯特氏菌科、莫拉菌科和黃色假單胞菌科各1株(表2)。水稻2個(gè)生育期分離到的固氮菌多數(shù)屬于γ-變形菌綱。
表1 拔節(jié)期水稻根系內(nèi)生固氮菌的分離鑒定結(jié)果
表2 抽穗期水稻根系內(nèi)生固氮菌的分離鑒定結(jié)果
表2(續(xù)) Continued table 2
2.2 內(nèi)生固氮菌16S rRNA基因測(cè)序與進(jìn)化樹
由圖1可以看出，在水稻拔節(jié)期，根系內(nèi)生固氮菌優(yōu)勢(shì)菌屬為克雷伯氏菌屬，分離到的4株克雷伯氏菌株聚類到同一分支，與不動(dòng)桿菌屬聚類關(guān)系最近，而與α-變形菌綱和β-變形菌綱的菌株聚類關(guān)系較遠(yuǎn)。從圖2可以看到，水稻抽穗期分離得到的固氮菌分成2個(gè)大的分支，6個(gè)假單胞菌屬菌株(H28、H37、H40-2、H31-1、H33和H15)聚類在一起，然后與腸桿菌屬、泛菌屬和氣單胞菌屬的菌株聚類為一大分支；
芽孢桿菌綱的H18，假單胞菌H42、H59，氣單胞菌H41、H47和H1-2聚為另一大分支。
圖1 拔節(jié)期水稻根系內(nèi)生固氮菌的進(jìn)化分析
圖2 抽穗期水稻根系內(nèi)生固氮菌的進(jìn)化分析
2.3 內(nèi)生固氮菌株的溶磷解鉀能力及固氮能力
溶磷解鉀能力驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離到的30株內(nèi)生固氮菌中有7株菌具有溶解無(wú)機(jī)磷能力，分別是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37(圖3)；
未發(fā)現(xiàn)具有解鉀能力的菌株。利用乙炔還原法鑒定除J57、J62、H15、H29-3、H30、H31-1、H43-3和H59外的22個(gè)內(nèi)生固氮菌的固氮酶活性，結(jié)果表明分離的多數(shù)菌株固氮酶活性較低，為1.05～1.73 nmol/(mL·h)，其中H33和H40-2菌株固氮酶活性相對(duì)較高，分別為12.7和15.1 nmol/(mL·h)。
圖3 水稻根系內(nèi)生固氮菌的溶磷能力
2.4 內(nèi)生固氮菌株對(duì)水稻促生能力的影響
由圖4可以看出，接種內(nèi)生固氮菌株組水稻幼苗的株高、地上部分鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量均高于對(duì)照組，其中接種H40-2和J3菌株處理的差異達(dá)到顯著或者極顯著水平；
內(nèi)生固氮菌對(duì)根長(zhǎng)影響不顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的內(nèi)生固氮菌對(duì)水稻幼苗有促生作用，尤其是H40-2和J3菌株。
*和**分別表示與對(duì)照相比，差異達(dá)顯著和極顯著水平。下同
由圖5可以看出，水稻幼苗經(jīng)混合內(nèi)生固氮菌侵染根部后，齊穗期臺(tái)粳8號(hào)倒1葉片、倒2葉片和倒3葉片SPAD值較對(duì)照顯著或極顯著增加，佳輻占各葉片SPAD值與對(duì)照無(wú)顯著差異，說(shuō)明混合重組菌液處理后臺(tái)粳8號(hào)在齊穂期氮吸收利用率較對(duì)照更高。
L1.倒1葉；
L2.倒2葉；
L3.倒3葉
不同植物間、同種植物不同基因型和不同發(fā)育階段根系中微生物菌群均具有明顯的差異[10-14]。研究人員從水稻中鑒定了多種內(nèi)生固氮菌，袁梅等[15]從水稻栽培品種中分離到19株內(nèi)生固氮菌，隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、Fictibacillus屬、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)；
譚志遠(yuǎn)等[16]從普通野生稻中分離到37株內(nèi)生固氮菌，其中γ-變形菌綱腸桿菌科的克雷伯菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)是優(yōu)勢(shì)菌屬。目前分離的內(nèi)生固氮菌多數(shù)屬于δ-變形菌綱、γ-變形菌綱和α-變形菌綱[3,17-18]，其多樣性與水稻發(fā)育時(shí)期密切相關(guān)，δ-變形菌綱相對(duì)豐度隨著水稻生長(zhǎng)發(fā)育的推進(jìn)逐漸增加，而厚壁菌門、β-變形菌綱和γ-變形菌綱逐漸減少[7]。本研究從拔節(jié)期和抽穗期佳輻占中分離到30株內(nèi)生固氮菌，均屬于變形菌門，隸屬于3綱9科12屬，其中假單胞菌科菌株最多，其次是腸桿菌科和氣單胞菌科，優(yōu)勢(shì)菌屬與前人研究結(jié)果[16]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在水稻拔節(jié)期根系內(nèi)生固氮菌以腸桿菌科為主，而抽穗期以假單胞菌科和氣單胞菌科為主，說(shuō)明水稻內(nèi)生固氮菌群多樣性會(huì)隨水稻的生長(zhǎng)發(fā)育而發(fā)生變化[6]。
植物根際微生物及根內(nèi)生微生物可以通過(guò)分泌植物激素、抑制病原菌或提高營(yíng)養(yǎng)元素吸收效率來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[8-9,19-21]，被稱為植物的“第二基因組”。擬南芥中，香豆素參與調(diào)控假單胞菌在根系的定殖，改善根系微生物群落組成，通過(guò)活化土壤鐵營(yíng)養(yǎng)而促進(jìn)植物對(duì)難溶性鐵的吸收利用[22-23]。水稻中分離的內(nèi)生固氮菌同時(shí)具有一定的溶磷能力，從而可促進(jìn)水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育[8-9,24]。前人從水稻根際、稻田土壤中分離的固氮菌亦多為假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等，并證明其對(duì)水稻等作物具有較好的促生長(zhǎng)作用，接種內(nèi)生固氮菌菌株的水稻幼苗地上部分干質(zhì)量與根干質(zhì)量顯著提高[24-25]。本研究對(duì)佳輻占根系內(nèi)生固氮菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)7株菌具有溶解無(wú)機(jī)磷的能力，并對(duì)水稻幼苗有促生作用，其中H40-2和J3菌株的促生作用最為明顯，這2個(gè)菌分別屬于假單胞菌屬和克雷伯氏菌屬，其促生機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。
生物固氮可為植物提供氮源，是替代氮肥的一種潛力氮源[26-27]。固氮菌是理想的植物促生菌，近年來(lái)在甘蔗、玉米、水稻等作物中發(fā)現(xiàn)大量的內(nèi)生固氮菌[18,28-32]，可為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供大量氮素從而減少氮肥的施用量。玉米的氣生根周圍也存在大量的固氮微生物，其通過(guò)固定空氣中的氮為玉米提供氮素，使玉米可以在低氮或不施氮肥的土壤中生長(zhǎng)[32]。將根瘤固氮菌工程菌株P(guān)seudomonasprotegensPf-5 X940分別接種玉米和小麥，并用15N同位素示蹤，發(fā)現(xiàn)玉米和小麥從固氮菌中獲得了大量的氮素[33]。水稻超高產(chǎn)也與水稻根系微生物多樣性有關(guān)[34]。水稻氮素的積累與齊穂期頂上3片葉的葉綠素含量(SPAD值)呈顯著正相關(guān)，通過(guò)測(cè)定生育后期功能葉中的葉綠素含量可判斷氮素的利用率[35]。本研究結(jié)果表明，分離的內(nèi)生固氮菌能使齊穂期臺(tái)粳8號(hào)倒1、倒2、倒3葉的SPAD值顯著提高，但對(duì)佳輻占葉片SPAD值無(wú)顯著影響，表明根內(nèi)微生物群落可能會(huì)影響秈粳稻對(duì)氮素的利用效率，這與前人研究結(jié)果[2,4]一致。
從拔節(jié)期和抽穗期水稻根系中共獲得30株內(nèi)生固氮菌，分屬于α、β、γ變形菌綱的多個(gè)科，內(nèi)生固氮菌具有多樣性，且拔節(jié)期與抽穗期的多樣性不同。從佳輻占根內(nèi)分離的內(nèi)生固氮菌可以促進(jìn)水稻幼苗生長(zhǎng)，尤其是H40-2和J3菌株對(duì)幼苗促生作用明顯。混合內(nèi)生固氮菌可顯著提高齊穂期粳稻葉片SPAD值，表明混合菌液可以顯著提高水稻的氮吸收效率。
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