張曉宇，龍妮婭，劉 健，3，出良釗，
(貴州醫科大學1.臨床醫學院、2.附屬醫院神經外科，3.貴州省人民醫院神經外科，貴州 貴陽 550004)
神經膠質瘤是神經外科常見的惡性腫瘤之一，是中樞神經系統最常見以及惡性程度最高的原發性腫瘤[1]。外科手術聯合放化療是其主要的治療方法，然而神經膠質瘤病人的預后較差[2]。神經膠質瘤細胞會侵入到人體顱腦的中樞神經系統，造成腦部腫瘤的侵襲及對顱腦的壓迫等一系列問題，給治療帶來了較多困難[3]。二氯乙酸鹽(dichloroacetate，DCA)是一種小分子物質，目前作為丙酮酸脫氫酶的抑制劑，應用于乳酸中毒的治療[4]。近年來，有文獻報道DCA能夠影響神經膠質瘤細胞和胰腺癌細胞的代謝，進而抑制細胞的增殖[5]。維生素C(vitamin C，VC)，又稱維他命C，是一種多羥基化合物，結構類似葡萄糖，其分子中第2及第3位上兩個相鄰的烯醇式羥基極易解離而釋出H+，故具有酸的性質，又稱L-抗壞血酸[6]。近年來，研究發現，藥物劑量的維生素C具有潛在的抗腫瘤活性，如胰腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌等，且藥物耐受性是在可接受范圍內[7]。此外，藥物劑量的VC可以增強腫瘤對藥物的敏感性[8]。如研究者發現VC可以穩定姜黃素在大鼠體內藥效的穩定性，協同姜黃素抑制小鼠結直腸癌腫瘤的生成[9]。然而，VC與DCA是否具有協同作用以及其作用機制仍不清楚。
本研究探討了DCA和VC聯合用藥后對神經膠質瘤細胞U87、U251增殖、遷移以及侵襲的影響，并分析其可能的作用機制，以期為臨床的神經膠質瘤治療提供潛在的治療策略。
1.1 材料
1.1.1細胞 人正常神經膠質細胞NHA以及神經膠質瘤細胞U87和U251均購自武漢Procell公司。
1.1.2主要試劑 Dulbecco′s modified eagle medium (DMEM)培養基(貨號：C11995500BT)購自美國Gibco生物公司；
青霉素-鏈霉素-兩性霉素三抗(貨號：J180027)購自索萊寶公司；
胎牛血清(FBS；
貨號：1913444)購自Biological industries公司；
DCA(貨號：HY-Y0445A)購自MedChemExpress公司；
VC(貨號：A800295)購自美國麥克林公司；
放線菌酮(CHX)購自Selleck生物公司；
CCK-8試劑(貨號：CK-04)購自日本同仁公司；
活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA貨號：CA1410)購自北京北奧萊博科技公司；
細胞凋亡試劑盒(貨號：40302ES60)購自上海翊圣生物公司；
細胞周期試劑盒(貨號：KGA511)購自南京凱基生物公司；
BALB/c雌性裸鼠(5周) 購自長沙天勤生物技術有限公司；
多克隆抗體BCL2A1(貨號：12789-1-AP)、CDC25A(貨號：55031-1-AP)、細胞色素C(Cytochrome,貨號：10993-1-AP)、caspase-7(貨號：27155-1-AP)、CDK4(貨號：11026-1-AP)、CDK6(貨號：14052-1-AP)和β-actin(貨號：20536-1-AP)均購自武漢三鷹Proteintech公司；
多克隆抗體cleaved-caspase-7(貨號：8438)購自于美國CST生物公司；
山羊抗兔二抗(貨號：BS13278)購自博士德有限公司；
Immobilon Western HRP曝光液(貨號：WBKLS0500)購自EMD Millipore公司。
1.1.3儀器 恒溫細胞培養箱(貨號：2001HY-6003，美國賽默飛公司)；
超凈操作工作臺(貨號：SW-CJ2D，蘇州凈化生物有限公司)；
Epoch型全波長酶標儀(貨號：ELx800，美國Bio-Tek公司)；
流式細胞儀(貨號：6890-5973N，美國安捷倫生物公司)；
倒置顯微鏡(DM500，德國徠卡公司)；
多功能成像系統(貨號：JP-K300，美國Bio-Rad公司)。
1.2 方法
1.2.1細胞培養與藥液配置 神經膠質瘤細胞NHA、U87和U251培養在完全培養基(高糖DMEM，其中添加10%胎牛血清FBS和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素)中，將其放置于37 ℃、含5%CO2的培養箱中培養。DCA、VC和CHX分別用DMSO配置為100 mmol·L-1的母液，使用前母液均存儲于-20 ℃冰箱。
1.2.2CCK-8法檢測神經膠質瘤細胞的活性 取細胞狀態良好且處于對數生長期的NHA、U87和U251細胞，5×103個/孔均勻接種于無菌的96孔板，每孔100 μL細胞；
分別予以0、1、2、3、4、5、6、7和8 mmol·L-1的VC處理NHA、U87和U251細胞；
在探究DCA與VC的協同效果時，分別以0、5、10、15、20和25 mmol·L-1的DCA單獨或聯合5 mmol·L-1VC處理U87和U251細胞，每組設置6個復孔。藥物處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，放置在培養箱中且避光孵育2 h后用酶標儀在450 nm處檢測其OD值。細胞增殖率/%=(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。此外，用金氏公式計算兩個藥物的協同作用。公式為：q=E(A+B)/[EA+(1- EA)·EB]，其中E(A+B)為兩藥物聯合作用細胞后的抑制率，EA、EB分別為單一藥物分別作用細胞后的抑制率，q>1.15為協同作用，實驗獨立重復3次。
1.2.3平板克隆實驗檢測神經膠質瘤細胞的增殖能力 取細胞狀態良好且處于對數生長期的U87和U251細胞(3×103個/孔)均勻接種于6孔板中，分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯合處理細胞，每組設置3個復孔。14 d后吸棄6孔板中的培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛溶液固定細胞25 min。吸棄4%的多聚甲醛溶液，用PBS清洗3次，每次3 min，再用0.1%結晶紫溶液在室溫下染色25 min。吸棄0.1%結晶紫溶液，用PBS清洗3次，每次3 min，烘箱過夜烘干，拍照，計數各組的克隆形成數，實驗獨立重復3次。
1.2.4流式細胞術檢測神經膠質瘤細胞的活性氧含量 取細胞狀態良好且處于對數生長期的U87和U251細胞，5×104個/孔均勻接種于6孔板中，待細胞24 h貼壁后，分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯合處理細胞。各組培養24 h后，用無EDTA的胰酶消化細胞并收集細胞，將提前配置好的1 ∶1 000用無血清培養基稀釋DCFH-DA加入各管細胞中，在37 ℃培養箱中培養20 min，用無血清培養基洗滌3次，室溫避光30 min內進行流式細胞儀的上機檢測。實驗獨立重復3次。
1.2.5流式細胞術檢測神經膠質瘤細胞的凋亡 細胞處理方法同“1.2.4”，加入15 μL的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer，Annex V-FITC)、5 μL的碘化丙啶(propidium iodide,PI)和400 μL的Loading buffer室溫避光30 min后，進行流式細胞儀的上機檢測。實驗獨立重復3次。
1.2.6流式細胞術檢測神經膠質瘤細胞的周期 細胞處理方法同1.2.4，加入5 μL RNase酶，在37 ℃恒溫搖床孵育15 min后，加入400 μL的碘化丙啶(propidium iodide,PI)室溫避光反應30 min后，進行流式細胞儀的上機檢測。實驗獨立重復3次。
1.2.7劃痕愈合實驗檢測神經膠質瘤細胞的遷移的能力 細胞處理方法同1.2.4，待培養至細胞密度為90%～100%融合度時，用200 μL槍頭在6孔板各孔底部做輕柔劃痕，用PBS清洗細胞3次，每次3 min。分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯合處理細胞，分別于0 h和24 h拍照，使用軟件ImageJ測量劃痕寬度，并計算細胞遷移率。細胞的遷移率/%=(0 h劃痕的寬度-24 h劃痕的寬度)/0 h劃痕的寬度×100%。實驗獨立重復3次。
1.2.8Transwell實驗檢測神經膠質瘤細胞的侵襲能力 用Matrigel膠均勻鋪于24孔板的小室上室內，取細胞狀態良好且處于對數生長期的U87和U251細胞(2×104個/孔)在無血清培養基混勻后接種于24孔板中上室。下室每孔加入700 μL的完全培養基。分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯合處理細胞，待24 h后，吸去上室和下室中的培養基，用4%的多聚甲醛溶液固定細胞25 min，吸棄4%的多聚甲醛溶液，用PBS清洗3次，再用0.1%結晶紫溶液在室溫下染色25 min。PBS清洗3次，烘箱過夜烘干。取出置于倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野(上、下、左、右和中)拍照并計數。實驗獨立重復3次。
1.2.9皮下移植瘤動物模型的建立 BALB/c雌性裸鼠(飼養于溫度為25 ℃，濕度在50%的環境下，光照時間為12 h·d-1，自由進食無菌水和無菌飼料，喂養1周適應新環境后接種細胞。本實驗經貴州醫科大學倫理委員會批準，并嚴格按照實驗，在每只裸鼠左側腋窩處給予U251細胞懸液0.1 mL(含2×106個細胞)。d 12后，挑選腫瘤體積在50～60 mm3的裸鼠，隨機分為4組，即DMSO、DCA單藥、VC單藥以及兩藥聯合處理組。DCA組每天瘤周注射15 mmol·L-1DCA液100 μL，VC組每天瘤周注射5 mmol·L-1VC液100 μL，聯合組每天瘤周注射含15 mmol·L-1DCA和5 mmol·L-1VC的混合液100 μL，而DMSO組則每天瘤周注射等體積DMSO。每3 d測量1次腫瘤體積，腫瘤體積:V=(長×寬)2/2。d 27對裸鼠進行安樂死處理，解剖腫瘤并拍照。
1.2.10DCA和VC在神經膠質瘤中的重要靶點預測分析 根據DCA、VC的藥效團，利用TargetNet(http://targetnet.scbdd.com/)分析預測DCA和VC的蛋白靶點，以Cytoscape軟件可視化藥物靶點的關系網絡。此外，運用在線工具GEPIA軟件(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析靶點的表達量與神經膠質瘤患者預后的關系。
1.2.11Western blot法檢測蛋白的表達 取細胞狀態良好且處于對數生長期的U87和U251細胞(1×106個/孔)均勻接種于6孔板中，待細胞密度至70%～80%的融合度后，以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯合處理細胞。處理48 h后，棄掉培養基，PBS洗滌后分別加入RIPA 細胞裂解液混合液100 μL，放置于冰上且在搖床上裂解20 min，收集含蛋白的裂解液于1.5 mL離心管中，于4 ℃、12 000 r·min-1離心后取上清液，運用BCA法定量相關蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液5×loading buffer混合，100 ℃，15 min。各加入25 μg蛋白樣品以110 V恒壓電泳，并以300 mA恒定電流將蛋白電轉移至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉封閉，分別加入BCL2A1、CDC25A、cytochrome C、caspase-7、cleaved-caspase-7、CDK4、CDK6和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。回收一抗后，用TBST清洗，加入山羊抗兔/山羊抗鼠二抗，室溫孵育，清洗條帶，曝光，于多功能成像系統曝光顯影。BCL2A1、CDC25A、cytochrome C、CDK4和CDK6以β-actin作為內參蛋白，cleaved-caspase-7以caspase-7為內參蛋白，根據其灰度值計算其相對表達量。實驗獨立重復3次。
1.2.12蛋白降解率檢測 用1 μmol·L-1放線菌酮(CHX)抑制U87和U251細胞的蛋白翻譯，同時分別給予DMSO、15 mmol·L-1DCA和5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯合處理0、0.5、1.0和2.0 h。RIPA裂解細胞，提取蛋白樣本，步驟同“1.2.11”，檢測各組細胞中BCL2A1和CDC25A的降解水平。
2.1 DCA、VC和兩者聯合作用對神經膠質瘤細胞增殖的影響CCK-8細胞結果(Fig 1A)顯示，VC對U87和U251的IC50為7.6 mmol·L-1和7.1 mmol·L-1。然而，此濃度對NHA有較大的非特異性毒性；
5 mmol·L-1VC對NHA毒性較低，被選做用于后續聯合的濃度。以不同濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的DCA單獨處理或聯合5 mmol·L-1VC處理U87細胞，聯合協同指數(q值)分別為0.91、1.33、1.75、1.47、1.40，其中，DCA單藥對U87的IC50為24.1 mmol·L-1，而存在5 mmol·L-1VC的情況下IC50為16.8 mmol·L-1。以不同濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的DCA單獨處理或聯合5 mmol·L-1VC處理U251細胞，各組聯合協同指數(q值)分別為0.87、1.30、1.67、1.40、1.38，其中，DCA單藥對U251的IC50為22.8 mmol·L-1，而存在5 mmol·L-1VC的情況下IC50為17.2 mmol·L-1。結果提示，10、15、20和25 mmol·L-1DCA與5 mmol·L-1VC能夠協同抑制神經膠質瘤細胞U87和U251細胞的增殖，其中，15 mmol·L-1DCA與5 mmol·L-1VC的聯合指數最佳，因此，選擇該聯合劑量用于后續研究。
Fig 1 Effects of different concentrations of DCA,VC and their combination on proliferation of neuroglioma U87 and U251 cells in vitro A:Effect of different concentrations of VC on proliferation of neuroglioma U87 and U251 cells;B:Effect of different concentrations of DCA combined with 5 mmol·L-1 VC on proliferation of neuroglioma U87 and U251 cells.**P<0.01 vs control.
2.2 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞克隆形成的影響克隆形成實驗結果(Fig 2)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯合用藥組中U87細胞的克隆形成數分別為(333±25.24)個、(241±10.50)個、(212±11.15)個、(113±10.21)個；
DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯合用藥組U251克隆形成數分別為(83±5.13)個、(64±3.22)個、(73±4.36)個、(31±7.51)個；
與DMSO對照相比，單藥和聯合處理后U87和U251細胞的增殖率均明顯減少(P<0.05)；
與單藥處理相比，聯合處理后U87和U251細胞的增殖率均明顯減少(P<0.05)。提示，VC能夠協同DCA抑制神經膠質瘤細胞克隆形成。
Fig 2 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on cell colonies of neuroglioma U87 and U251 *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.
2.3 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞產生活性氧含量的影響流式細胞術結果(Fig 3)顯示，與DMSO對照相比，單藥處理后U87和U251細胞的活性氧含量增加不明顯；
然而，與對照組和單藥處理組相比，聯合處理后U87和U251細胞的活性氧含量明顯增加。提示，VC能夠協同DCA促進神經膠質瘤細胞的活性氧生成。
Fig 3 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on reactive oxygen content of neuroglioma U87 and U251
Fig 4 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on apoptosis of neuroglioma U87 and U251 *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.
2.4 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞凋亡的影響流式細胞術結果(Fig 4)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯合用藥組中U87細胞的凋亡率分別為(2.39±0.67)%、(5.49±0.27)%、(7.12±1.05)%、(17.56±0.68)%。DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯合用藥組中U251細胞的凋亡率分別為(2.76±0.56 )%、(6.22±0.92)%、(5.98±1.43)%、(16.22±1.02)%；
與DMSO對照相比，單藥和聯合處理后U87和U251細胞的凋亡率均明顯增加(P<0.05)；
與單藥處理相比，聯合處理后U87和U251細胞的凋亡率均明顯增加(P<0.05)。提示，VC能夠協同DCA促進神經膠質瘤細胞的凋亡。
2.5 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞周期的影響流式細胞術結果(Fig 5)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯合用藥組中U87細胞在G1期的百分比分別為(51.39±1.19)%、(57.48±2.05)%、(56.53±1.01)%、(74.72±1.50)%；
在S期的百分比分別為(33.23±0.86)%、(28.57±0.79)%、(29.84±2.86)%、(21.60±1.03)%；
在G2/M期的百分比分別為(16.41±1.06)%、(13.49±1.09)%、(11.42±0.62)%、(5.46±0.84)%。DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯合用藥組中U251細胞在G1期的百分比(24.31±2.32)%、(44.48±2.20)%、(46.92±1.58)%、(62.83±2.21)%；
在S期的百分比分別為( 31.72± 1.52)%、(28.91±1.78)%、(28.11±1.55)%、(25.09 ±1.80)%；
在G2/M期的百分比分別為(43.84±1.67)%、(22.53±1.47)%、(22.81 ±1.86)%、(8.23 ±1.88)%。與DMSO對照相比，單藥和聯合處理后U87和U251細胞的阻滯在G1期的細胞百分比均明顯增加(P均<0.05)；
與單藥處理相比，聯合處理后U87和U251細胞的阻滯在G1期的細胞百分比均明顯增加(P<0.05)。提示，VC能夠協同DCA誘導神經膠質瘤細胞阻滯在G1期。
2.6 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞遷移的影響劃痕實驗結果(Fig 6)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯合用藥組U87細胞遷移率分別為(100.00±7.00)%、(44.33±4.90)%、(56.00±5.60)%、(26.33±4.50)%；
DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯合用藥組U251細胞遷移率分別為(100.00±8.50)%、(66.00±10.40)%、(73.33±1.70)%、(37.33±3.50)%。與DMSO對照相比，單藥和聯合處理后U87和U251細胞的遷移率均明顯減少(P<0.05)；
與單藥處理相比，聯合處理后U87和U251細胞的遷移率也均明顯減少(P<0.05)。提示，VC能夠協同DCA抑制神經膠質瘤細胞的遷移能力。
Fig 5 Effect DMSO,DCA,VC and their combination on cell cycle of neuroglioma U87 and U251 *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.
2.7 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞侵襲的影響Transwell小室實驗結果(Fig 7)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯合用藥組中U87細胞侵襲細胞數分別為(850±36)個、(440±40)個、(449±30)個和(80±17)個；
DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯合用藥組中U251細胞侵襲細胞數分別為(868±66)個、(729±34)個、(423±20)個和(76±15)個。與DMSO對照相比，單藥和聯合處理后U87和U251細胞的侵襲細胞數均明顯減少(P均<0.05)；
與單藥處理相比，聯合處理后U87和U251細胞的侵襲細胞數也均明顯減少(P<0.05)。提示，VC能夠協同DCA抑制神經膠質瘤細胞的侵襲能力。
2.8 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞U251體內增殖的影響如Fig 8，與DMSO對照組相比，DCA和VC單藥處理后U251形成的腫瘤組織體積減少；
與DCA和VC單藥相比，兩者聯合處理后，腫瘤組織體積明顯減少(P均<0.05)。
2.9 分析DCA與VC在神經膠質瘤中的重要靶點根據DCA和VC的藥效團，利用在線軟件TargetNet預測發現，DCA有36個可能的作用靶點，VC有9個可能的作用靶點。其中，有7個蛋白靶點為兩者共同的作用靶點，如CDC25A、S1PR2、PPO2F、DPS、BCL2A1、ALOX15和CES1(Fig 9A-B)。其中，對作用靶點與神經膠質瘤患者的預后關系進行分析發現，高表達蛋白靶點BCL2A1和CDC25A患者較低表達患者總體生存率明顯減少(Fig 9C-D)。提示，抑制BCL2A1和CDC25A是治療神經膠質瘤的一種治療策略，BCL2A1和CDC25A可能是DCA和VC在神經膠質瘤中發揮作用的重要靶點。
Fig 6 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on migration of neuroglioma U87 and U251 using wound *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.
Fig 7 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on invasion of neuroglioma U87 and U251 cell using *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.
2.10 DCA聯合VC對神經膠質瘤細胞BCL2A1、CDC25A、CDK4、CDK6、cytochrome C和cleaved- caspase-7的影響Western blot結果(Fig 10)表明，與DMSO對照組相比，DCA和VC以及兩者聯合處理后U87和U251細胞中BCL2A1、CDC25A、CDK4和CDK6的表達量明顯減少(P<0.05)，cytochrome C和cleaved-caspase-7的表達量明顯增加(P<0.05)；
與DCA和VC單獨用藥組相比，兩者聯合處理后U87和U251細胞中BCL2A1、CDC25A、CDK4和CDK6的表達量也明顯減少(P<0.05)，cytochrome C和cleaved-caspase-7的表達量也明顯增加(P<0.05)。
2.11 VC聯合DCA對BCL2A1和CDC25A蛋白降解率的影響基于BCL2A1和CDC25A可能是DCA聯合VC的重要靶點，我們以CHX抑制細胞的蛋白合成后，探究各組細胞中BCL2A1和CDC25A蛋白的降解率。結果提示(Fig 11)，與DMSO對照組相比，各處理組BCL2A1和CDC25A蛋白的降解率均明顯增加。與DCA和VC單藥相比，聯合組中BCL2A1和CDC25A蛋白的降解率明顯增加。提示，VC和DCA兩者聯合具有促進BCL2A1和CDC25A降解的作用。
Fig 9 Prediction of target proteins of BCL2A1 and CDC25 action (A,B) between DCA and VC,the prognosis of patients between BCL2A1 and CDC25A (C,D)
Fig 10 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on expression of BCL2A1,CDC25A,CDK4,CDK6,cytochrome C, caspase-7,cleaved-caspase-7 proteins in neuroglioma U87 and U251 cells detected by Western blot A:Protein expression in U87;B:Protein expression in U251.*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.
Fig 11 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on expression of BCL2A1, CDC25A U87 and U251cells detected by Western blot A:Protein expression in U87;B:Protein expression in U251.
神經膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，由于神經膠質瘤的發病位置比較特殊，正常的腦組織與腫瘤組織之間的邊界較模糊，通過外科手術徹底清除病灶的難度較大，治療效果較差且容易復發，病死率高[10]。因此，開發新的治療藥物對神經膠質瘤的治療有重要意義。
DCA是一種臨床上用于治療糖尿病的代謝調節劑。近年來，研究發現DCA能夠抑制丙酮酸脫氫酶激酶的活性，繼而減少乳酸的形成，因此可以逆轉瓦爾堡效應，促進腫瘤細胞的凋亡[11]。DCA能夠通過促進YAP通路抑制肝癌細胞的增殖[12]。此外，Korsakova等[13]研究發現，DCA和二甲雙胍聯合用藥可以靶向抑制體內外神經膠質瘤細胞的生長。因此，DCA與其他藥物聯合應用可能成為提高療效的一種可行方法。有研究發現高劑量VC對多種惡性腫瘤,例如淋巴瘤等,均有明顯的治療效果,并有臨床試驗證實了靜脈滴注大劑量VC對惡性腫瘤的治療效果甚佳[14]。此外，研究發現，VC是一種良好的增敏劑，與多種傳統的化療藥物有協同作用[8]。
本研究通過CCK-8實驗發現，VC與多個濃度(10、15、20和25 mmol·L-1)的DCA具有協同作用。其中，5 mmol·L-1的VC與15 mmol·L-1的DCA的協同效果最佳。進一步，以該協同濃度處理神經膠質瘤細胞U87和U251細胞。克隆平板、流式細胞術、劃痕實驗以及transwell小室實驗分析發現，5 mmol·L-1的VC與15 mmol·L-1的DCA能夠協同減少神經膠質瘤細胞U251和U87的克隆形成、遷移和侵襲能力，并明顯誘導細胞活性氧含量的增加，細胞凋亡和G1期阻滯。此外，皮下成瘤實驗表明，5 mmol·L-1的VC與15 mmol·L-1的DCA能夠明顯抑制神經膠質瘤細胞U251體內的增殖。這些證據均表明，DCA和VC聯合可能是抑制神經膠質瘤細胞惡性行為的一種有效治療策略。
網絡藥理學是通過生物信息學手段，預測及模擬藥物分子與靶蛋白之間的相互作用，為分子的作用提供間接或直接證據。為探究DCA和VC是如何發揮協同機制的，本研究基于DCA和VC的藥效團進行網絡藥理學分析，發現DCA有36個潛在作用靶點,VC可能有9個潛在作用靶點。兩者取交集得到7個共同靶點，其中包括BCL2A1、CDC25A和S1PR2等。進一步生物信息學發現，高表達BCL2A1和CDC25A的神經膠質瘤患者總體生存率較低。BCL2A1是BCL-2家族的一個抗凋亡成員，半衰期較短，這限制了其固有的促生存活性，這一特征與它的兩個近親MCL-1和BCL-B相同。有文獻報道，降解BCL2A1可促進細胞內Cytochrome C的增加和釋放，進而誘導腫瘤細胞的凋亡。CDC25A是CDC25磷酸酶家族的一員，可以調控周期蛋白CDK4/CDK6復合物，從而調節細胞周期進程[15]。CDC25A的表達在多種腫瘤中表達升高，如神經膠質瘤等[16]。此外，研究發現，CDC25A能夠通過活化多個信號通路如FAK和AKT等促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[17]。
為探究DCA與VC的協同機制是否與抑制BCL2A1和CDC25A相關，本研究進行了Western blot實驗，結果發現，DCA能夠協同VC抑制BCL2A1和CDC25A的表達，并減少CDC25A下游CDK4和CDK6的表達。CDK4/CDK6是細胞通過G1期檢查點必要的蛋白，該實驗結果與流式細胞術G1期阻滯結果一致。此外，BCL2A1下游的Cytochrome C和cleave-caspase-7在聯合處理后也明顯增加。已有研究表明，藥物與靶點蛋白直接結合后，可僅影響蛋白的修飾水平(不影響表達)，也可能會影響蛋白的構象改變，進而影響蛋白降解[18]。進一步，為證實VC和DCA是否具有直接影響BCL2A1和CDC25A的作用，我們以CHX抑制U87和U251細胞中的蛋白合成，發現，VC和DCA均能促進BCL2A1和CDC25A的降解率，兩者聯合誘導蛋白降解的效果更加明顯。結果提示，DCA和VC可能是協同促進BCL2A1和CDC25A的降解，發揮其作用的。
綜上所述，VC能夠協同DCA促進BCL2A1和CDC25A的降解，抑制神經膠質瘤細胞的惡性行為。VC聯合DCA可能是神經膠質瘤治療的一種可行策略。
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