曲永嘉，孫曉偉,2，周國興,2，程遠志，戴鴻哲，李洪濤,2※
（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；
2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；
3.哈爾濱工業大學計算學部，黑龍江 哈爾濱 150090；
4.哈爾濱工業大學土木工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090）
骨質疏松癥（Osteoporosis,OP）是一種由多原因導致的全身性骨病[1]，其臨床表現多為疼痛、脊柱變形以及非外傷或輕微外傷引發的脆性骨折[2]。現階段臨床上以絕經期婦女和老年人的原發性骨質疏松最為常見，患者的骨密度和骨質量變差，骨微結構被破壞，生活質量受到極大影響。
近年來，大量研究表明一些中藥成分能夠通過信號通路的調節，使骨細胞的合成增多，并對一些破壞骨細胞的物質起抑制作用，進而達到改善骨質疏松的目的。杜仲為杜仲科植物杜仲的樹皮，性溫，味甘微辛，歸肝、腎經，有補肝腎、強筋骨的效用。其中富含的黃酮類物質已被證實在防治OP中有著顯著的效果[3]，同時杜仲還具備價格相對較低、副作用較小的優點。所以，深入研究杜仲在骨質疏松防治中的作用機制，對其臨床使用和相關藥物研究都有著非常重大的意義。
因中藥具有多組分、多靶點的特征，目前關于杜仲有效成分在基因水平上防治OP作用機制的研究相對較少，所以本文采用網絡藥理學的研究方法，旨在通過生物信息學分析、探究杜仲藥物活性成分所對應的疾病靶點基因是如何通過信號通路來發揮作用的，為臨床上進一步研究杜仲的作用機制、研發相關新藥提供參考。
1.1 數據庫與軟件
本研究中所使用的數據庫及軟件，見表1。
表1 本研究所使用的數據庫與軟件Table 1 The database and software used in this research
1.2 方法
1.2.1 杜仲有效活性成分的篩選與作用靶點預測在TCMSP數據庫中以“杜仲”為關鍵詞進行搜索，數據庫中提供了其組成化學物質的一系列參數。本文將以口服生物利用程度（Oral Bioavailability,OB）、類藥性（Drug-Likeness,DL）這兩種有重要含義的指數對研究對象加以選擇。把OB值不低于30%且DL值不低于0.18的成分作為研究對象，同時在數據庫中使用其對應的MOL ID完成對于預測作用靶點的檢索。
1.2.2 杜仲有效活性成分作用靶點基因名標準化將預測靶點的名稱輸入UniProt數據庫中，將其轉化為數據庫中記載的與人類有關的國際通用標準化基因名。其中部分作用靶點的作用對象不是人類，對于這部分靶點進行剔除，不予研究。
1.2.3 杜仲有效活性成分作用靶點網絡的構建將所獲取的有效活性成分進行編號，與標準化后的基因名導入Cytoscape 3.7.1軟件做可視化處理，構建關于有效活性成分作用靶點的網絡圖。
1.2.4 骨質疏松疾病靶點的篩選在GeneCards、OMIM以及DrugBank這3大數據庫中以“Osteoporosis”為關鍵詞檢索得到與骨質疏松有關的疾病靶點，將從3個數據庫中得到的數據進行匯總與去重。
1.2.5 杜仲骨質疏松共同靶點的篩選將骨質疏松的疾病靶點與去重后的杜仲作用靶點做韋恩圖，分析韋恩圖得到藥物疾病的共同靶點。
1.2.6 共同靶點的PPI網絡構建將共同靶點的基因名導入STRING 11.5數據庫中，minimum required interaction score選擇0.4，其他條件選擇默認參數，執行后得到共同靶點的蛋白質蛋白質網絡。
1.2.7 杜仲骨質疏松關鍵靶點的篩選將上一步構建的PPI網絡中的相關數據以文本形式導出，再利用Cytoscape 3.7.1自帶的Network Analysis工具進行數據分析，以度值（Degree）與節點中心性（Betweenness Centrality）為依據分別選出前20位的靶點，取交集得到關鍵作用靶點。
1.2.8 GO功能與KEGG通路的富集分析將關鍵靶點的基因名導出，在R 4.1.2中對這些關鍵靶點進行GO功能與KEGG富集分析，富集結果中以P＜0.05的數據具有統計學意義，再利用R 4.1.2將富集程度較好的條目進行可視化。
1.2.9 主要活性成分與關鍵靶點的分子對接利用Cytoscape 3.7.1建立起杜仲活性成分、骨質疏松和關鍵靶點之間的網絡關系，對該網絡進行網絡分析，找出該網絡中的主要活性成分和主要作用靶點，分別在PubChem數據庫和PDB數據庫中下載活性成分與主要作用靶點對應受體蛋白的3D模型，將二者在PyMOL 2.2.0中進行預處理后導入AutoDock 4.2.6中進行分子對接試驗。
2.1 杜仲有效活性成分的篩選
將TCMSP數據庫中得到的數據按照條件篩選，剔除重復值，獲得杜仲有效活性成分共計25個（表2），預測作用靶點共計202個，使用Cytoscape構建的杜仲有效活性成分作用靶點網絡圖見圖1。
圖1 杜仲有效活性成分 作用靶點網絡圖Fig.1 Composition target network diagram of Eucommia ulmoides
表2 杜仲有效活性成分Table 2 Effective active components of Eucommia ulmoides
2.2 杜仲 骨質疏松共同作用靶點的篩選
以“Osteoporosis”為關鍵詞檢索，在GeneCards、IMOM以及DrugBank 3大數據庫中去除重復值后共得到4 603個疾病作用靶點，與杜仲的202個有效活性成分作用靶點做韋恩圖（圖2）取交集得到共同作用靶點144個。
圖2 杜仲骨質疏松的共同作用靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of Eucommia ulmoides and osteoporosis disease targets
2.3 共同靶點的PPI網絡構建
將共同靶點導入STRING 11.5數據庫中，這144個靶點共產生了2 671條相互作用的連線，PPI網絡圖見圖3。
圖3 杜仲骨質疏松共同靶點的PPI網絡圖Fig.3 PPI network diagram of the common target of Eucommia ulmoides in the treatment of osteoporosis
2.4 杜仲 骨質疏松關鍵靶點的篩選
將STRING中得到的PPI網絡相關數據導入Cytoscape 3.7.1中，經Network Analysis進行分析，見圖4。其中的氣泡越大，相關連接愈粗且愈多的節點在該PPI網絡中也愈重要。這些點都是通過度值、節點中心性分析確定的。分別選取這兩個參數中的前20個靶點，二者重合的部分就是該網絡的關鍵靶點。分析后得到14個關鍵靶點，這些靶點在網絡中的信息見表3。
表3 14個關鍵靶點Table 3 Fourteen hub targets
圖4 杜仲骨質疏松關鍵靶點的網絡分析圖Fig.4 Hub target network diagram of Eucommia ulmoides in the treatment of osteoporosis
2.5 GO功能富集分析
對GO功能分別進行細胞組成（Cellular Component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）和生物進程（Biological Process,BP）的富集分析，并將富集結果的前20條進行可視化，其中CC只富集到10條，僅對這10條GO功能進行可視化，見圖5。由富集結果可知，這些關鍵靶點在細胞中主要參與組成轉錄調控復合物、膜筏、膜微區和常染色質等結構，通過行使與轉錄因子、酶和蛋白受體結合的功能對細胞增殖、基因沉默、化學應激反應及氧化應激反應等生物進程起調控作用。
圖5 杜仲治療骨質疏松的GO功能富集結果Fig.5 GO function enrichment analysis Eucommia ulmoides in the treatment of osteoporosis
2.6 KEGG信號通路富集分析
對關鍵靶點進行KEGG富集分析，將前20條通路進行可視化，見圖6。由富集結果可知，杜仲防治骨質疏松的關鍵靶點主要在與人體代謝、炎癥反應和病毒感染等有關的通路中被大量富集。除去其中調節范圍較廣的信號通路后發現，這些關鍵靶點主要富集在IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）以及雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）中，即這些通路的調節可能與杜仲防治骨質疏松有著緊密的聯系。
圖6 杜仲治療骨質疏松的KEGG通路富集分析結果Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of Eucommia ulmoides in the treatment of osteoporosis
2.7 主要活性成分與關鍵靶點的分子對接
由Cytoscape 3.7.1構建杜仲防治骨質疏松的“藥物疾病靶點”網絡（圖7），對該網絡進行分析可知，杜仲與關鍵靶點產生關聯最多的主要活性成分為槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）和-谷甾醇（Betasitosterol），這些活性成分的具體信息見表4。在該網絡中還可以得到前列腺素內過氧化物合酶（prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2）、熱休克蛋白90A1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG）和JUN原癌基因（jun proto-oncogene,JUN）這4個關鍵靶點與藥物產生的關聯較多，將主要活性成分分別與這4個關鍵靶點中對應的靶點進行分子對接試驗并得出對接的最低活化能（表5），并將其中對接活化能最小的幾個模型進行可視化，見圖8。對接結果顯示，分子與受體蛋白的最低對接活化能均低于20.93kJ/mol，說明分子對接效果良好，同時也說明了中藥多組分與多靶點的結合效果良好，能夠通過與多靶點作用發揮防治疾病的功效。
圖8 分子對接模型Fig.8 Molecular docking model
表5 杜仲主要活性成分分子對接結果Table 5 Eucommia ulmoides molecular docking of main components
圖7 “藥物疾病靶點”網絡圖Fig.7 Network diagram of“Drug Disease Target”
表4 杜仲主要化學成分Table 4 Important chemical components of Eucommia ulmoides
中藥作為一種天然藥物，其組分十分復雜，具有多組分多作用靶點的特征，若依舊采用傳統的細胞或者動物實驗很難明確闡述清楚其多組分的作用機制，所以應用網絡藥理學，以龐大的化學成分、基因、靶點和疾病數據庫作為支撐，將單味中藥的組成成分拆解開來，將其導入龐大且復雜的網絡數據庫中，利用構建網絡的方式分析節點之間的關系可以從一定程度上闡明其主要的作用機制。
本研究中，通過“藥物疾病靶點”網絡發現杜仲防治骨質疏松的主要活性成分為槲皮素、山柰酚和-谷甾醇。槲皮素可以有效的抗衰老，它不僅可以清理衰老的骨髓間充質干細胞，還可以不斷補充該細胞，減少細胞的流失[4]。該成分作為黃酮類化合物，在動物實驗中[5]已經被證實可以通過上調成骨細胞下調破骨細胞來改善實驗對象的骨質。有研究表明[6]，山柰酚可以通過刺激Wnt/-catenin這一協調控制成骨細胞分化的通路，抑制IL-6的表達，使由破骨細胞引導的骨吸收過程減緩，讓骨的形成與吸收過程重新趨于正常狀態，使得骨重建處于一個穩態過程，以達到防治骨質疏松的目的。-谷甾醇具有較好的抗炎作用，-谷甾醇可以通過抑制NF-B和細胞外調節激酶的信號傳導來降低炎癥的發生，并且可以使一些與骨質疏松有關的炎癥因子，如IL-6、TNF-等的表達水平顯著降低以達到防治骨質疏松的目的[7,8]。
由本研究中構建的PPI網絡共篩選出了14個關鍵靶點，其中PTGS2、HSP90AA1、PPARG、ESR1和JUN這5個靶點與杜仲活性成分的關聯最為緊密，在相關網絡中占據著重要地位。PTGS2可以促進前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）的表達，而PGE2可以通過激活蛋白激酶B（Akt）誘導骨形成，同時PGE2還可以與核因子B配體受體激活因子（receptor qctivator for nuclear factor-B ligand,RANKL）聯合作用抑制甲狀旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）的持續表達，促進骨的合成[9,10]。在Chen等[11]的實驗中，當成年小鼠成骨細胞中的PTGS2基因被敲除時，其骨流失顯著加快，骨密度大幅下降，這也說明了PTGS2與誘導成骨細胞分化促進骨形成的進程有關。HSP90AA1在研究中被證實可以促進細胞的自噬，當HSP90AA1正常表達時可以通過自噬作用參與到骨重建的過程中，可以促進骨質的更新，但當其異常過量表達時則可能對某些癌變細胞的耐藥性產生影響，不利于異常細胞的凋亡[12]。在骨骼中，PPARG的活性與調控骨髓基質干細胞向成骨或成脂方向分化有著緊密的聯系，通常當PPARG被激活活性增強時會增加破骨細胞的吸收活性，并使骨髓基質干細胞向形成脂肪細胞的方向發展，抑制骨形成，加速骨流失[13,14]。有研究證實[15]，B細胞中ESR1的表達水平下降時，與破骨細胞生成有關的因子表達水平會升高，而與成骨細胞生成有關的因子則會減少表達，骨吸收和骨形成穩態被打破導致骨質疏松的惡化。JUN有促進成骨的潛能，它可以誘導骨損傷部位細胞構建鈣化組織，加速骨缺損的填充[16]。以上事實說明，這些關鍵靶點可以通過調控骨吸收與骨形成來影響骨質疏松的疾病進程。
本研究將杜仲主要活性成分槲皮素、山柰酚和-谷甾醇分別與關鍵靶點PTGS2、HSP90AA1、PPARG和JUN進行了分子對接試驗，由分子化學結構式及對接模型可知，-谷甾醇分子中有一個羥基，羥基上的氫原子與電負性大、半徑小的氧原子以共價鍵的形式相結合，當有其他電負性大的原子接近羥基時會形成分子間氫鍵將二者結合，因氧原子本身的電負性也很大，且羥基氧上有兩對孤對電子可以與其他符合條件的氫原子形成兩個氫鍵，所以羥基既可以作為氫鍵供體也可作為氫鍵受體，即小分子的羥基處可以形成多重氫鍵。由-谷甾醇的對接模型可知，-谷甾醇在與PTGS2、HSP90AA1蛋白進行對接時羥基作為氫鍵供體分別與氨基酸殘基Asp134和Ile218形成氫鍵相互作用，而在與JUN蛋白進行對接時羥基作為氫鍵供體在氫原子處與氨基酸殘基Asp189形成氫鍵，作為氫鍵受體在氧原子處與氨基酸殘基Asn194、Arg107形成氫鍵。山柰酚分子中除能形成多重氫鍵的羥基外，還含有羰基和醚鍵且其中的氧原子均含有兩對孤對電子，所以山柰酚與PTGS2的對接模型顯示，山柰酚分子中的羥基分別與氨基酸殘基Pro155、Pro154、Gln462、Asn34、Trp323、Ser49和Ser548形成氫鍵相互作用，羰基及醚鍵分別與氨基酸殘基Ser49、Gly136形成氫鍵相互作用，其中氨基酸殘基Asn34、Ser49還以多重氫鍵的形式與山柰酚分子進行了對接，使得山柰酚與PTGS2蛋白的結合更為穩固。同時，分子與受體蛋白的最低對接活化能均低于20.93 kJ/mol，說明各分子與靶點蛋白之間的對接效果良好，也證實了中藥相關組分可與多靶點相結合來發揮防治疾病的功效。
GO功能富集結果顯示，杜仲防治骨質疏松的關鍵靶點主要對細胞增殖、基因沉默、化學應激反應和氧化應激反應等生物進程起調控作用。而KEGG富集分析結果顯示，這些關鍵基因主要富集在與炎癥因子及激素受體有關的信號通路中。
IL-17與TNF信號通路主要與炎癥有關。其中IL-17由T細胞亞群釋放，IL-17在正常生理條件下可與受體結合誘導成骨細胞的合成，而過量的IL-17則會刺激成骨細胞祖細胞分泌RANKL從而使得破骨細胞的增殖能力提高[17,18]。TNF通路則可以誘導IL-6炎癥因子的產生，進而對骨組織產生影響[19]，同時該通路的主要調節因子TNF-能夠影響成骨細胞的活性，抑制其分化，使丟失的骨無法得到及時補充引發骨質疏松[20]。雌激素可以與雌激素信號通路中的雌激素受體相結合，對破骨細胞和成骨細胞的生長凋亡發揮調控作用[21,22]，還有研究證實，當雌激素缺乏或破骨細胞中的雌激素受體表達受限時，破骨細胞被激活，骨流失加快[23]。以上事實說明，IL-17、TNF和雌激素信號通路以及通路中的相關因子主要通過調控細胞增殖與炎癥反應來影響骨質疏松的發展進程。
綜上所述，本研究應用網絡藥理學的分析方法，分析了杜仲在防治骨質疏松這一疾病時的具體作用機制，發現PTGS2、HSP90AA1、PPARG、ESR1和JUN等靶點為防治骨質疏松的關鍵靶點，這些靶點會影響細胞增殖、基因沉默和相關細胞反應等多個生物進程，并通過IL-17信號通路、TNF信號通路以及雌激素受體信號通路等通路實現對于骨質疏松的防治。但由于網絡數據庫仍在不斷更新擴充，具有一定的局限性，以上結論仍需進一步的實驗探究去印證。
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