吳丹，楊苗苗，杜小平，祁蒙，楊水云
(1.陜西學前師范學院 生命科學與食品工程學院,西安 710100；
2.安康市富硒產品研發中心，陜西 安康 725000；
3.西安交通大學 生命科學與技術學院，西安 710049)
納豆激酶(NK)是納豆中最具開發價值的成分，該酶為枯草蛋白酶類第一個具有纖溶作用的酶，可以應用于臨床的溶栓治療過程中[1]。納豆激酶是一種由納豆芽孢桿菌發酵產生的堿性胞外絲氨酸蛋白酶，具有良好的溶栓作用[2]，可有效預防或治療心腦血管疾病[3-4]。該酶與目前溶栓藥物如尿激酶(urokinase，UK)和鏈激酶(streptokinase，SK)相比，具有pH廣[5]、溫度耐受性強及溶栓特異性等優點[6—7]。
Chandrasekaran等[8]發酵生產的NK可溶解94%的人工血栓；
Janh等[9]研究表明NK在小鼠體內有一定的溶栓效果；
Hsia等[10]和Yuko等[11]研究證實口服NK后，NK在體內有良好的溶栓效果。NK的優勢在于其對纖維蛋白，尤其是對交聯的纖維蛋白特別敏感，可直接作用于血栓中的纖維蛋白,將其溶解為小肽和氨基酸[12—13]。這一特性使得NK更偏好溶解血栓中的纖維蛋白而不易溶解血漿纖維蛋白原，因而不會破壞正常凝血機制而引發出血，且目前臨床現用的溶栓劑無此特點，但目前NK產品純度較低，因此，提高NK純度意義重大。
工業上生產NK都是從納豆桿菌的發酵液中提取純化的。報道的NK純化方案，常集多種手段聯合使用。但在總結前人純化結果后發現[14—19]，使用柱層析法，NK的酶活回收率普遍不高，不僅如此，柱層析法也具有成本高、方法繁瑣、步驟較多、耗時且難以規模化生產的缺點[20]。超濾法可以有效地去除料液中相對分子質量較大和較小的組分，避免了鹽析方法中高滲作用所造成的酶活性降低，但純化倍數很低。利用親和吸附法對NK純化，例如用大豆顆粒對NK進行特異性吸附，吸附的配體結構不清楚[21]，操作較為復雜，不適合工業化生產。
在納豆桿菌發酵豆類制作的納豆表面，可以看見很長的拉絲狀黏液。在納豆桿菌發酵黃豆粉產生NK的液體發酵中，也總是伴隨著大量黏液的產生，其產量遠遠大于NK，現已研究清楚，該黏液的主要成分為γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-pGA)[22—25]，分子量為100～1 000 kDa，等電點為2.5，屬于典型的酸性高聚物，而NK的分子量僅為27.7 kDa，等電點為8.7。在pH 7.0～7.5的發酵液中，NK帶正電而γ-pGA帶負電，二者通過靜電力以“偶聯狀態”結合，形成以大分子量的γ-pGA為載體的多分子納豆激酶聯合物，從而大大降低了NK的表觀活性[26]。目前，基于以上工藝的NK產品無法實現微劑量服用目標，更不能滿足注射針劑的要求，因此要獲得高純度的NK，需要將大量γ-pGA從粗產品中去除。
本研究在建立可行的液體發酵法生產NK工藝的基礎上，提出了從發酵液純化NK的下游方案，該方案大幅度提高了NK的純度。
1.1 材料
1.1.1 菌株和供試樣品
納豆芽孢桿菌N5：西安交通大學生命學院基礎實驗室分離純化所得；
供試樣品為市售的脫脂豆粕及黃豆。
1.1.2 試劑及培養基
試劑：纖維蛋白原、凝血酶、尿激酶和γ-聚谷氨酸，購自上海源葉生物科技有限公司；
瓊脂糖，購自Amresco公司；
十六烷基三甲基溴化銨，購自Alfa Aesar公司；
BCA蛋白定量試劑盒，購自碧云天生物技術。其余化學試劑均為國產分析純。
LB培養基：用于菌種的活化及種子液的配制。1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl。
天然發酵培養基：用于納豆激酶的發酵。3%脫脂豆粕勻漿攪拌，用1 mol/L NaOH溶液調節培養基pH為7.4左右，121 ℃高壓滅菌20 min。
1.1.3 主要儀器設備
THA-3560C立式滅菌鍋 Tsao Hsin公司；
酶標儀 Molecular Devices公司；
BSA124S 電子天平 德國Sartorius公司；
PYX-DHS-40X50電熱恒溫培養箱 廣州滬瑞明儀器有限公司；
LYZ-Z00B恒溫搖床 上海龍躍儀器設備有限公司；
Centrifuge 5810R離心機 Eppendorf公司；
SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇凈安泰公司；
冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 納豆芽孢桿菌N5的培養及發酵方法
將納豆芽孢桿菌N5接種于LB液體培養基中，在37 ℃條件下，在轉速200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養至對數期測定其吸光度，計算接種量。
3%的脫脂豆粕勻漿攪拌，用1 mol/L NaOH溶液調節培養基pH為7.4左右，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。冷卻至室溫后接種。納豆芽孢桿菌種子液的接種量為0.05 OD/mL，恒溫37 ℃，搖床轉速200 r/min，發酵時間36 h。發酵完成后，發酵液于2 000 g條件下離心10 min，上清液為液體發酵的納豆激酶溶液，利用纖維蛋白原平板法測定NK產量(Fu/g豆粕)。
1.2.2 納豆激酶活力的測定
納豆激酶的活力采用纖維蛋白原平板法[27]。根據樣品的數量，用直徑為2 mm的打孔器進行打孔。
1.2.3γ-聚谷氨酸的定量檢測方法
在已有檢測方法[28]的基礎上進行如下改良：在350 nm的波長條件下，采用CTAB的NaOH溶液(10 g/L)檢測γ-pGA。
1.2.4 納豆激酶發酵培養基的優化
1.2.4.1 單因素條件優化
根據前期預實驗結果，在確定發酵培養基中碳源為1%的甘油的基礎上，以納豆激酶的活力為指標，采用單因素實驗研究豆粕、谷氨酸鈉及無機鹽含量對發酵結果的影響。發酵培養基的豆粕含量為1%、3%、5%、7%、9%；
谷氨酸鈉的質量濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、3%；
MgSO4·7H2O的質量濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%。以天然發酵培養基為對照。按0.05 OD/mL接種納豆桿菌種子液，在37 ℃、200 r/min的條件下發酵36 h，測定纖溶圈直徑，選取適宜的單因素條件。
1.2.4.2 多因素正交優化
在以上描述的各個單因素優化的基礎上，根據正交表設計正交實驗，優化最優碳氮源質量濃度、谷氨酸鈉及硫酸鎂含量等。測定并比較培養基優化前后的NK產量(Fu/mL)。
1.2.5 納豆激酶與γ-聚谷氨酸解離及收集
在培養基中接種0.05 OD/mL的納豆芽孢桿菌N5，37 ℃下200 r/min發酵36 h。用pH 10、10倍的Gly-NaOH緩沖液調節發酵液的pH至10，使得NK和γ-pGA均帶負電，不再緊密結合。充分振蕩混勻后，在2 000 g條件下離心10 min，收集上清液，沉淀用pH為10的Gly-NaOH緩沖液洗滌1次，2 000 g條件下再離心10 min，合并上清液待用。
1.2.6 不同pH值下NK產量的測定
發酵完成后，取原始發酵液1 mL，用pH為10的Gly-NaOH緩沖液調節pH至10，稀釋至 2 mL，在渦旋儀上激烈振蕩后，2 000 g條件下離心10 min后取上清液，采用纖維蛋白原平板法測定上清液的NK產量；
以原始發酵液稀釋1倍作對照。
1.2.7 十六烷基三甲基溴化銨沉淀γ-聚谷氨酸條件優化
將不同濃度的CTAB水溶液與“1.2.1”中得到的NK溶液等比例混合，用力搖勻后在1 000 g下離心10 min。收集含有NK的上清液，并分別測定上清液中殘留的γ-pGA含量和NK的效價，得到去除γ-pGA的方案。
1.2.8 三相法濃縮提取納豆激酶
采用三相法濃縮含有NK的上清液，具體參考張慶慶等[28-31]的方法進行。
1.2.9 納豆激酶凍干粉效價測定
磁力攪拌條件下，在pH 8.7、0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，對三相法收集的中間NK相進行透析，每隔2 h換液，2～3次后，于4 ℃進行透析過夜。透析液置入培養皿中，厚度在1 cm左右，放入-80 ℃冰箱中預凍，取出后放入冷凍干燥機中干燥24 h，即為高純NK凍干粉。取NK凍干品5 mg，溶于0.5 mL 0.05 mol/L的Gly-NaOH緩沖液中(pH 10)(NK的最適pH為9～10)，充分振蕩混勻后，采用纖維蛋白原平板法測定對應產品的效價。
1.2.10 計算公式
NK回收率的計算方法：回收率(%)=(離心后單位體積酶活×離心后酶溶液體積)/(離心前單位體積酶活×離心前酶溶液體積)。
NK比活力的計算方法：比活力(Fu/mg)=總活力/總蛋白。
NK純化倍數的計算方法：純化倍數=離心后的比活力/離心前的比活力。
2.1 尿激酶標定的納豆激酶酶活工作曲線
采用已知的不同效價標準尿激酶溶液，測定其在人工血栓平板上形成的纖溶圈直徑，纖溶酶可以使乳白色的纖維蛋白原降解為無色透明的片段和小肽，從而形成透明圈。可根據圖1中纖維蛋白原平板上透明纖溶圈的大小和圖2中標準曲線來表征尿激酶的纖溶活性。由圖2可知，在尿激酶酶活為200～1 000 U/mL的區間內R2=0.996 6，酶活和直徑的平方值有很強的線性相關性。因此，可以利用此標準曲線標定NK的酶活。
圖1 標準尿激酶纖溶圈
圖2 尿激酶標準曲線
2.2 豆粕含量對納豆激酶活力的影響
在天然培養基中，豆粕的含量決定了納豆芽孢桿菌生長的營養條件。在5種豆粕粉濃度下，發酵36 h后于2 000 g條件下離心10 min，取上清液，利用纖維蛋白原平板法測定上清液NK產量，結果見圖3。
圖3 豆粕含量對NK產量的影響Fig.3 Effect of soybean meal content on NK yield
由圖3可知，豆粕含量為1%時，NK產量為808 Fu/mL，豆粕含量為3%時，NK產量為1 009 Fu/mL，豆粕含量大于5%時，NK產量緩慢降低。可見當豆粕含量較低時，NK產量也低，原因是可供納豆芽孢桿菌生長發酵的營養不足；
當豆粕含量升高時，營養充足，NK產量緩慢降低，原因可能是豆粕濃度較大，導致溶氧量較低，不利于納豆桿菌的生長及發酵。后續實驗中選擇的豆粕含量為3%。
2.3 谷氨酸鈉含量對納豆激酶活力的影響
研究報道發現添加谷氨酸鈉可以提高NK的分泌[32]，本研究對谷氨酸鈉含量進行了優化，結果見圖4。
圖4 谷氨酸鈉含量對NK產量的影響
由圖4可知，谷氨酸鈉的添加可以提升NK的產量，當發酵培養基中谷氨酸鈉從0.5%增加到2%時，NK的產量逐漸上升到1 309 Fu/mL；
當谷氨酸鈉含量超過2%時，NK的產量會降低，所以選擇谷氨酸鈉的最佳含量為2%。
在實驗中我們還發現，隨著谷氨酸鈉含量的升高，發酵液會更黏稠，說明谷氨酸鈉濃度越高，納豆桿菌分泌的γ-pGA就越多，這是因為谷氨酸鈉是γ-pGA分泌的前體物質[33]。由于γ-pGA和NK等電點的巨大差異，在發酵液中二者會結合在一起。NK一旦被γ-pGA結合，就變成束縛型的NK，使其表觀活性下降，不利于其作用于大豆蛋白供給菌體以充足氮源。此時γ-pGA就相當于NK的“代償陷阱”[34]，致使菌體以代償方式不斷合成NK，最終提高了NK的產量。基于以上分析，實驗結果表現為NK的產量與γ-pGA的含量呈正相關。所以通過添加谷氨酸鈉，可提升NK產量。但當谷氨酸鈉添加過量時，溶液過于黏稠，導致發酵液溶氧降低，影響了納豆桿菌的好氧生長，生長量下降，需要的氮源下降，因而NK產量也隨之降低。
2.4 Mg2+含量對NK產量的影響
Mg2+在蛋白質包括NK的合成中起著非常重要的作用，因而實驗對發酵體系中Mg2+的濃度進行了優化。Mg2+對NK產量的影響的實驗結果見圖5。
圖5 MgSO4·7H2O含量對NK產量的影響
由圖5可知，NK產量隨著MgSO4·7H2O含量的升高出現先升高后下降的趨勢，當MgSO4·7H2O含量為0.3%時，NK產量最高。
2.5 正交法優化天然培養基
根據以上單因素實驗結果，研究通過多因素正交實驗法優化天然培養基中甘油、谷氨酸鈉和硫酸鎂的含量，實驗結果見表1。
表1 不同添加物正交實驗結果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiment of different additives
由表1中R值可知，在目前設計的實驗條件下，谷氨酸鈉對NK產量的影響最大，因此我們需進一步優化谷氨酸鈉的濃度。由k值可知，降低谷氨酸鈉濃度更合理。
分析各k值可知，在本實驗設計條件下，最適培養基添加物為甘油0.5%、谷氨酸鈉1%、MgSO4·7H2O 0.5%。在此培養基條件下重復進行NK發酵和產量測定，結果見圖6。
圖6 培養基優化前后NK產量對比Fig.6 Comparison of NK yield before and after the optimization of medium
由圖6可知，當培養基的組成為豆粕3%、甘油0.5%、谷氨酸鈉1%、MgSO4·7H2O 0.5%時，NK產量為1 486.6 Fu/mL，比優化前提高了48%。在此培養基條件下重復進行NK發酵和產量測定，結果穩定，重復性良好。
2.6 不同pH下所獲納豆激酶的產量
原始發酵液(pH為7)和調節pH為10后的發酵液NK的效價測定結果見圖7。
圖7 pH對NK產量的影響
由圖7可知，pH為7的條件下所獲粗酶液中NK效價為1 526 Fu/g，調節發酵液pH為10，即大于NK的等電點時，所獲NK效價為2 123 Fu/mL，提高了39%。pH為7的條件下獲得的NK凍干粉效價為1.88×104Fu/g，調節pH為10后，所獲NK凍干粉效價為2.55×104Fu/g，比堿法解離前提高了41%。
2.7 CTAB沉淀γ-聚谷氨酸
十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)在水溶液中以聚陰離子形式存在，CTAB的氮原子可與γ-pGA中的羧基氧原子配對形成不溶于水的γ-pGA-CTAB絡合物，反應后溶液變渾濁[28]，離心沉淀可去除γ-pGA。優化CTAB的濃度，使γ-pGA的沉降量最大，且最大程度地保持NK活性穩定。CTAB濃度對γ-pGA含量的影響見圖8，CTAB濃度對NK活性的影響見圖9。
圖8 CTAB濃度對殘留γ-pGA含量的影響Fig.8 Effect of CTAB concentration on residual γ-pGA content
圖9 CTAB濃度對NK活力的影響Fig.9 Effect of CTAB concentration on NK activity
對NK活性以及殘留γ-pGA含量進行綜合分析，逐漸提高CTAB濃度，上清液中γ-pGA的殘留量變化不大，但是NK的纖溶活性逐步降低。結合實驗結果及成本考慮，選擇最佳沉降的CTAB濃度為0.2 mol/L。
2.8 三相法濃縮提取納豆激酶效果
固定叔丁醇 ∶料液(體積比)為1∶1，且保證叔丁醇的高度大于0.5 cm，通過改變容器直徑來改變相界面面積，可發現相面積越大，越有利于傳質，因而提取率和回收率隨之增大，當硫酸銨終飽和度為50%時，結果見圖10。
圖10 不同大小接觸面積下的NK純化效果Fig.10 Purification effect of NK under different contact areas
實驗結果發現，叔丁醇相與水相的相界面越大，NK回收率越高，純化倍數基本不變。這意味著當相界面面積不足時，夾層中NK分子達到飽和造成分子擁堆，難以將水相中的NK一次性全部提取到夾層。因此在實際應用中，可以通過增加提取次數來減少NK的損失。
三相法中，若只進行一次提取，水相中的蛋白質不能完全分布到中間相，水相中的大部分NK很有可能并不能完全分布到夾層。在首次吸取夾層后，對剩余水相再次進行提取，如此反復使水相中的NK基本全部被萃取完全。在硫酸銨終飽和度為50%、接觸面積直徑為7.1 cm時，對NK進行多次提取，實驗結果見圖11。
圖11 不同提取次數下的NK純化效果Fig.11 Purification effect of NK under different extraction times
實驗結果發現，隨著提取次數的增加，NK的活力回收率和純化倍數逐漸增加，提取3次時，NK活力回收率為87%，純化倍數為35.3，提取4次時，NK活力回收率為91%，純化倍數為35.7，基本不再增加，說明提取4次可基本把水相中的NK提取到中間沉淀相。因此在利用三相法濃縮純化NK時，選擇提取4次。
實驗結果表明，蛋白的回收率隨著體系中料液與叔丁醇接觸面積的增大而升高，在叔丁醇與料液的體積比為1的條件下，若可保證叔丁醇在上相中的高度不小于0.5 cm，則接觸面積越大越好。在本實驗的體系中，提取4次可基本把水相的NK提取完，若體系不同，還需對提取次數進行優化，理論上提取次數越多，NK提取越完全。
利用沉淀劑CTAB對粗酶液中的γ-pGA進行沉降，對沉降后的上清液采用三相法進行濃縮，回收效果好。NK活力回收率為91%，純化倍數為35.7。
2.9 高純納豆激酶凍干粉的效價
通過沉淀法及三相夾心法獲得的NK凍干粉，其效價高達(7.88±0.76)×105Fu/g，獲得的高純NK凍干粉形態見圖12。
圖12 高純NK凍干粉形態Fig.12 Morphology of high-purity NK lyophilized powder
由圖12中A可知，獲得的高純NK凍干粉蓬松細膩，呈乳白色。由圖12中B可知，高純NK品相好，滿足商品要求。若作為口服制劑，可制備成微膠囊(2.5～7.6 mg裝量)，大大減少消費者的口服劑量，還為注射針劑的進一步研發打下良好基礎。
實驗結果說明，當pH為10時，NK與γ-pGA均帶負電，相互排斥，解離結合，與γ-pGA偶聯的NK會游離至上清液中，從而提高了NK效價或產量。高pH有利于NK從γ-pGA上解離，提高NK回收率。考慮到過高pH對NK酶活的影響，后續純化工藝中采用pH為10的條件。
堿法解離后在2 000 g條件下離心去除大分子的γ-pGA，經凍干，檢測初純NK效價為2.55×104Fu/g，與現有產品相比，其效價屬于中等偏上水平，可作為保健品原料，但還是無法滿足微劑量服用的要求。若利用CTAB對粗酶液中剩余的γ-pGA進行沉淀，再對沉淀后的上清液采用三相法進行濃縮純化，可大幅度提高納豆激酶的效價，獲得的高純NK效價為(7.88±0.76)×105Fu/g，超過了目前所能了解到的所有產品的純度，使濃縮型微量NK口服制劑的制備成為可能，也為注射針劑的研發打下良好基礎。
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