林 源 ，譚 磊，何世成，唐小明，王衛國，王昌建
（1.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南 長沙 410014；
2.湖南農業大學，湖南 長沙 410128）
豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）屬于皰疹病毒科成員，該病原宿主范圍廣泛，可感染多種哺乳動物（包括家畜和野生動物），并導致偽狂犬病（pseudorabies, PR）。PR主要以發熱、腦炎或奇癢等臨床癥狀為特征，不同動物感染PR后所表現的臨床癥狀差異較大[1]。其中毛皮動物（如牛、羊、兔和狐貍等）以瘙癢、神經癥狀等為主，且死亡率高達100%；
但豬感染不會出現瘙癢，可出現腦炎、腹瀉和發熱等，且死亡率相對較低。豬（包括家豬和野豬）是PRV的自然宿主，在自然環境下豬群感染PR的主要途徑是通過口鼻直接或間接接觸病原而感染。不同日齡豬群感染該病后表現的臨床癥狀差異較大，2周齡內的新生仔豬表現出神經癥狀、腹瀉等，且死亡率較高；
肥育豬感染后僅出現輕微的呼吸道癥狀及食欲不振等；
妊娠母豬則出現嚴重的繁殖障礙疾病[2]。
得益于PRV-gE基因缺失疫苗（如Bartha株），我國的PR流行情況得到有效的抑制，甚至部分地區豬場將PR進行了成功凈化。2011年末，我國河南地區部分已免疫PRV疫苗的豬場仍然暴發了PR，其后該病以河南地區為中心，在我國各省市豬場廣泛報道。研究人員對致病原進行分離鑒定后，發現其病原特征與PRV相同，且進一步進行基因序列特征性分析發現此類毒株的某些基因（gB、gE和gD等）與PRV傳統株（如Ea和Fa株）、PRV疫苗株（如Bartha株）對應基因序列有很大的差異，如連續氨基酸序列缺失或插入、單個氨基酸突變等，部分變異區域處于病原的抗原區域，故研究人員又將新發的PRV毒株稱為PRV變異株[3]。
隨著PR在我國各地區豬場的廣泛流行，導致PRV接觸其它哺乳動物的幾率提高，特別是一些偏遠地區農戶將豬和其它PRV易感動物（如牛、羊和狗）混養，這導致其它動物感染PR的幾率提高。此外，也有越來越多食肉動物食用感染PRV的豬肉或豬內臟而感染PR的案例被報道，且這些報道在山東、河南等地區較為常見。此外，近年來PRV可感染人這一事實也逐漸引起國內外專家學者的廣泛關注[3]。
自2011年以來，國內學者進行了大量的工作以監測PRV血清學流行情況，但不同地區數據質量差異較大。湖南農業大學Tan等曾對2011—2019年期間全國各地區豬PRV-gE抗體檢測結果數據進行統計發現，全國共29個省市開展過PRV野毒血清學調查研究，其調查數據共包括256 326份血清樣本，其中76 553份樣品檢測為PRV-gE抗體陽性，平均陽性率近30%（29.87%），其中9個省市被調查樣品PRV-gE抗體陽性率超過30%[2]。楊漢春等曾于2016—2018年對我國規模化豬場偽狂犬病病毒血清學感染情況進行調查，結果發現2016—2018年被調查地區PRV-gE抗體場陽性率分別為80.93%、81.92%和75.75%，樣品陽性率分別為36.03%、34.52%和32.45%。進一步分析發現不同地區樣品陽性率存在很大差異，以2018年為例，黑龍江、天津、湖南和內蒙古等地區陽性率較低，但北京、安徽和遼寧等地區陽性率則較高。此外，PRV野毒感染與豬群生產模式、種公豬是否感染等具有一定關系[4]；
王昌建等調查結果表明，2018年湖南省規模化豬場PRV-gE場陽性率為38.9%，樣品陽性率為21.0%，其中不同規模化豬場中以母豬存欄量高于1 000頭的豬場PRV-gE陽性率最高（22.9%），且夏季豬群PRV-gE抗體陽性率最高（25.1%）[5]；
Zheng等調查結果發現，2018—2019年河南省被調查豬群血清PRV-gE抗體陽性率為30.14%（1 419/4 708），其中不同發育階段豬群中以肥育豬陽性率最高[6]。
為確切知曉PRV在豬群的分子生物學流行情況，很多研究人員針對PRV的特定基因（如gE、gD和gC等）設計相應的病原診斷方法（如PRV、realtime PCR法等）對PRV核酸進行檢測。誠然，由于PRV核酸檢測過程相對復雜，且檢測過程需要專業的儀器和工作人員，這導致PRV的分子流行病學研究相對血清學研究較少。湖南農業大學Tan等曾對2011—2019年國內發病豬群PRV分子流行病學調查結果進行統計，27個具有代表性的研究報告中采集了16 256份組織樣品用于PRV核酸檢測，其中有4 742份（約8.0%比例）樣品為陽性[2]。華中農業大學Sun等[7]在2012—2017年對我國27個省市送檢病料進行PRV核酸檢測，調查結果發現16 256份組織樣品中有1 345份樣品為陽性，其平均陽性率為8.27%，且2012—2017年被檢樣品PRV核酸陽性率分別為11.92%、12.19%、6.70%、11.10%、5.57%和6.90%；
不同地區中以山東、江蘇、福建等東部省份檢出率相對較高（平均檢出率為11.60%），而北部省份（如青海、**和甘肅等）檢出率相對較低，平均陽性率為6.97%。汪一平等[8]對豫西地區采集的臨床病料進行檢測發現，2016—2020年該地區PRV病原檢出率為13.82%（21/152），其中以2017年和2018年檢出率相對較高，分別為20.69%和19.05%。周莉媛等于2019—2020年對四川省11個地區送檢病料進行PRV核酸檢測發現，466份病料中有51份為陽性，平均陽性率為10.94%，且不同發育階段豬群陽性率存在較大差異，其中肥育豬、保育豬、妊娠母豬陽性率均超過11%，分別為17.96%、11.26%和13.41%；
哺乳仔豬、種公豬陽性率較低，分別為4.76%和2.63%[9]。從以上調查數據來看，我國豬群送檢病料中PRV核酸平均檢測陽性率為10%左右，雖然在地區上有很大的差異，但病原檢出率始終低于基于PRV-gE的血清學檢出率。這是由于豬群感染PRV后可終生帶毒，這導致豬群體內PRV-gE抗體可長時間保持陽性；
且PRV在潛伏感染時可存在于三叉神經節和扁桃體，這時豬群既不會發病，也不會排毒，病原學監測過程中不容易檢測到PRV核酸的存在。
PRV屬于DNA病毒，其基因組較為穩定，雖然PRV廣泛流行于世界各地，但其僅存在一種血清型，盡管不同毒株的毒力或致病力存在很大的差異。根據PRV基因組（如gC基因）特征，可將全世界流行的PRV毒株分為2個基因型，分別為genotype Ⅰ和genotype Ⅱ型，其中大部分國外（如歐洲、美國等地區）流行PRV毒株屬于genotype Ⅰ型，而大部分國內和亞洲部分地區（如日本）流行PRV毒株屬于genotype Ⅱ型。此外，當前國內流行的毒株中存在genotype Ⅰ、genotype Ⅱ型，且genotype Ⅲ毒株可再次分為genotype Ⅱ-A和genotype Ⅱ-B亞型，其中，國內2011年以前流行的PRV毒株主要屬于genotypeⅡ-A，而2011年以后流行的毒株則主要屬于genotypeⅡ-B型。此外，南京農業大學動物醫學院Su等比較了國內流行PRV變異株、傳統株和疫苗株之間的氨基酸序列遺傳多樣性，發現變異株（Qihe547毒株）與國內流行變異株、傳統株和疫苗株氨基酸序列同源性分別為99.54%、98.84%和95.06%，其中在某些基因序列中變異株與疫苗株存在很多的氨基酸差異，其中包括有氨基酸插入或缺失。以gC基因為例，與國外genotype Ⅰ基因型流行株相比，國內變異株和傳統株氨基酸序列中第63～69位均存在7個氨基酸連續插入（63AAASTPA69）。
此外，雖然DNA病毒基因組較為穩定，但大量不同基因型的PRV毒株流行也容易導致PRV重組毒株的出現（雖然重組可能性較低）。南京農業大學Zhia等對我國2017—2019年流行的PRV毒株部分序列進行分析時發現，2株來自于福建地區的毒株（FJ-W2和FJ-ZXF）gD和gE基因序列與國內流行的變異株（genotype-Ⅱb）同源性最高，但其gB基因卻與國外流行的疫苗株（genotype Ⅰ）在進化樹上位于同一分支，提示這兩個毒株在不同基因型之間發生了重組。此類報道還有很多，其中中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所Liu等研究發現，基于MCC法構建的PRV基因組全長的系統進化樹HLJ-2013毒株位于genotype Ⅰ和genotype Ⅱ之間，其分支雖然也是在genotype Ⅱ之中，但與genotype Ⅱ其它毒株（如傳統株Ea和變異株HN1201）均不在一個分支上；
且進一步研究發現，該毒株基因組多區域出現重組，其UL27和UL36基因位于兩種基因型毒株之間，UL17和UL37基因位于genotype Ⅰ基因型，但US4和US6基因則與genotype Ⅱ毒株中傳統株相距最近。雖然當前已經有很多PRV重組毒株被鑒定出來，但與PRV變異株或疫苗株相比，這些重組毒株的毒力和致病性是否發生了變化還有待進一步的研究探索。
4.1 血清學診斷技術
血清學檢測技術是基于抗原與抗體的特異性結合反應，同時結合相應的可視化檢測方法。動物感染病原后可針對病原結構蛋白而產生特異性的抗體，且這些特異性抗體存在于血清中。因此，研究人員可通過靜脈采集血液，其后分離血清，應用血清學診斷技術對特定病原抗體進行檢測。
針對PRV的血清學診斷技術較為特殊，PRV基因組龐大，可編碼多種蛋白，其中部分基因（如TK）僅與病毒毒力相關，而與病毒的免疫原性無關。目前絕大部分PRV疫苗是gE基因或多基因缺失疫苗，豬群免疫接種此類疫苗后可產生針對PRV的中和抗體，但不會產生gE蛋白抗體，而野毒感染后的豬群可產生gE蛋白抗體，因此靶向gE抗體設計的血清學檢測方法可區分野毒感染和疫苗接種豬群。目前很多企業或科研單位開發了系列針對PRV的血清學診斷技術，根據原理主要可分為酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光技術（IFA）和血清中和試驗（IHA）等。
4.1.1 ELISA檢測技術 ELISA（酶聯免疫吸附試驗）檢測技術是OIE（世界動物衛生組織）推薦首選的血清學診斷方法，其具有很高的簡便性和敏感性，適合大量樣品的快速檢測，因此，ELISA是目前實驗室診斷血清抗體最常用的一種檢測方法。目前，美國愛德士（IDEXX）公司生產的PRV-gE和gB抗體ELISA檢測試劑盒是同類產品中最為權威的，該公司于20世紀80年代就已開發了此類ELISA試劑盒，并于1988年成為美國官方首個批準的PRV鑒別診斷試劑盒，在美國PR凈化項目中發揮了重要作用。但為降低檢測成本，國內部分單位自主研發了PRV鑒別診斷試劑盒，部分產品的敏感性和特異性與IDEXX公司產品相比不相上下。
4.1.2 間接免疫熒光技術 IFA（間接免疫熒光技術）是一種實驗室用于診斷特定病原的方法，其原理是抗原與抗體的特異性結合，但最終觀察結果需要借助熒光顯微鏡。其基本步驟是將已知抗體與病原充分結合，其后用洗滌液將未結合抗體洗去，然后用熒光標記的抗抗體（抗IgG或IgM抗體）與抗體結合，如果已知抗體與病原發生特異性結合，則在顯微鏡下可觀察到熒光，若未結合則觀察不到熒光。因此，該方法可用于病原的檢測，且該方法也可以檢測病原在特定組織或細胞中的分布情況，具有高特異性和靈敏性。
4.1.3 血清中和試驗 IHA（血清中和試驗）被視為血清學診斷技術中的“金標準”，其原理是具有感染性的病原與中和抗體結合后失去感染力，通過倍比稀釋血清抗體，最后計算可中和病原的最低血清稀釋度，以此確定血清中是否存在特定病原的抗體及其中和能力。因此，該方法也是判定豬群免疫接種疫苗后對野毒抵抗力最準確的方法。對于PRV的IHA血清學診斷而言，可將具有感染性的特定病毒載量與血清在室溫反應2 h后，將上清液接種于單層的PRV易感細胞（如豬腎上皮細胞，PK15），其后觀察細胞是否會出現病變。如果細胞沒有出現病變，則表明血清中存在PRV的中和抗體，如果有細胞病變，則代表血清中不存在針對PRV的中和抗體。但是，該技術不適用于區分PRV野毒感染或疫苗接種豬群，只能用于判斷豬群是否產生針對病原的特異性中和抗體。
4.2 病原診斷技術進展
針對PRV-gE抗體的血清學診斷技術可用于快速區分野毒和疫苗毒株感染的豬群，但為進一步提升檢測技術的多樣性，越來越多針對PRV核酸的檢測技術被研發出來，這些核酸檢測技術都是在體外通過各種方法將特定核酸片段以指數式擴增后，借助不同的方法判定目的片段是否存在。其中最具有代表性的檢測方法有聚合酶鏈式反應（PCR）、實時熒光定量PCR（real-time PCR）、環介導等溫擴增（LAMP）檢測技術等。
4.2.1 聚合酶鏈式反應 PCR（聚合酶鏈式反應）方法具有操作簡單、快速等特點，同時也具備很高的敏感性和特異性，該技術廣泛應用于病原的核酸檢測。對于PRV的核酸檢測也是得益于PRV-gE基因缺失疫苗的使用，針對PRV-gE基因研發的核酸檢測技術可區分疫苗感染和野毒感染。范克偉等[10]基于PCR法建立鑒別野毒感染的雙重PCR核酸診斷方法，該方法可同時擴增PRV-gE（400 bp）和PRV-gB（582 bp），其檢測敏感度可達10 pg/μL。由于當前生豬養殖過程中多種病原混合感染現象十分常見，因此也有研究人員基于PCR法開發了多種病毒同時檢測的多重PCR方法。貴州大學Liu等針對6種常見病原（PRV、豬細小病毒、豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬乙腦病毒）建立了多重PCR診斷方法，該技術對以上病原核酸的靈敏度分別為6.6 pg、96.0 pg、12.9 pg、10.5 pg、51 pg和46 pg，十分適合單個樣品多種病毒的同時檢測，極大地節省了時間和成本[11]。
4.2.2 實時熒光定量PCR技術 隨著科研人員和養殖企業對病原診斷的便捷性和靈敏性要求越來越高，近年來越來越多檢測中心或科研單位采用real-time PCR技術對病原進行檢測，其檢測原理與PCR類似，但較PCR技術的靈敏度和便捷性更高，因為該技術不需要對產物進行凝膠電泳，且可以通過計算機分析樣品Ct值來初步判斷樣品中載毒量情況，這可以減少樣品檢測過程中的污染情況。當前絕大部分企業或單位都普遍采用商業化的real-time PCR試劑盒對PRV病原進行檢測，當然也有部分院所自己研發相應的檢測方法，且檢測效果較為理想。侯月娥等基于PRV-gE基因建立了一種可用于檢測PRV野毒的TaqMan熒光定量PCR方法，該方法對PRV野毒檢測靈敏極限為100 copies/μL，是普通PCR法的100倍，該方法可用于檢測野毒感染及PRV弱毒疫苗中是否存在野毒污染[12]。與多重PCR類似，也有研究人員建立了可同時檢測PRV和其它病毒的多重real-time PCR檢測方法，Tian 等曾建立可同時檢測PRV野毒和PCV3的real-time PCR方法，該方法對以上兩種病原的靈敏度極限分別為37.8 copies/μL和30.6 copies/μL，且同時檢測兩種病毒，則檢測極限為60 copies/μL[13]。
4.2.3 環介導等溫擴增（LAMP）檢測技術 LAMP屬于一種新型的核酸體外擴增檢測技術，該方法的運行原理是恒溫條件下（65 ℃左右）利用一對內外引物和Bst DNA聚合酶與模板形成啞鈴狀DNA，并以其為模板不斷進行復制，該技術檢測成本較低，操作方便，當前已廣泛應用于多種病原的核酸檢測。鄭書軒等應用LAMP建立了一種PRV野毒的快速檢測技術，該方法僅需1 h在65 ℃恒溫條件下便可以對病原進行檢測，且其靈敏度為1.0 copy/μL，較常規PCR技術更為敏感，且經過染色后可直接眼觀觀察結果[14]。然而，LAMP技術引物設計難度較大，檢測靈敏度太高，在檢測過程中容易出現假陽性問題。
對PRV核酸檢測的技術遠不止real-time PCR、PCR和LAMP這些方法，還有類似重組酶聚合酶擴增技術（RPA）、微滴式數字PCR法（ddPCR）等，且這些方法均表現出十分優秀的敏感性和特異性，但是，檢測體系容易污染、檢測成本高、需要特別的儀器設備等問題限制了其進一步的應用。值得注意的是，當前可以用二代測序（NGS）技術檢測未知病原，雖然NGS技術可全面檢測送檢樣品中所有的病原，且也有研究人員將該技術應用于PRV核酸檢測[15]，但該技術檢測成本高、耗時長，應用于豬場常規病原診斷較少，一般是用于科研機構或醫院等單位。
4.2.4 病原分離結合其它實驗室診斷技術 此外，對于病原診斷也有公認的“金標準”，即為病原分離結合后續系列鑒定。由于PRV可感染多種細胞，且很容易對病毒進行分離，目前已有很多科研機構將該病原分離出來。PRV的分離主要可分為以下幾個步驟：將疑似或確定PRV感染的病料無菌處理（剪碎、勻漿、離心取上清液后無菌過濾）；
其后接種于單層易感細胞（如PK15細胞），直至出現明顯病變；
最后收取上清液提取基因組DNA用于PCR檢測，或使用IFA或IHA等技術對上清液中病原進行檢測，或可將病毒富集后用于電鏡觀察病原形態，根據病原形態對其進行初步鑒定。但因病毒分離需要專業的儀器設備，檢測時間長，對人員的專業水平要求較高，所以一般不適用于豬場對疫病的快速診斷。