黃梓泓， 宋鴻志， Edward J. Kennelly, 譚欽剛,*
( 1. 桂林醫學院， 中國 廣西 桂林 541199；
2. 紐約城市大學， 美國 紐約 10468 )
絡石藤作為常見中藥，在我國具有悠久的應用歷史，始載于《神農本草經》，被列為上品，2020年版《中華人民共和國藥典》中記載其為夾竹桃科植物絡石(Trachelospermumjasminoides)的干燥帶葉藤莖(國家藥典委員會，2020)。絡石藤主要含木脂素類、三萜類等化學成分，具有抗炎鎮痛、抗腫瘤、抗病毒等作用，民間主要用于治療風濕熱痹、腰膝酸痛等癥，現代臨床廣泛用于與炎癥和疼痛相關的疾病，如關節炎、類風濕性關節炎等(李金生等，2016；
Zhao et al., 2017)。因民族用藥習慣不同，所以桑科榕屬植物地果(Ficustikoua)的新鮮或干燥地上部分——地瓜藤在不同地區被用作絡石藤(宮璐等，2016)。該植物主要含黃酮類、酚酸類及萜類等化學成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等活性，主要用于清熱利濕、活血通絡、解毒消腫等(周芹茹等，2020；
楊燁等，2021；
Yao et al., 2022)。上述兩種藥材在科屬來源、化學成分及臨床應用方面存在差異，其抗炎活性及相應的化學成分差異尚未明確。
中藥材化學成分研究是闡明中藥材藥效物質、作用機制以及臨床療效的先決條件(鄭敏霞等，2011；
汪小莉等，2018)，傳統分離方法費時費力且消耗大量藥材，利用現代技術如超高效液相色譜-串聯四級桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術可以為不同樣品間化學成分差異及品質評價提供參考，如da Silva等(2017)通過該法結合多元統計學鑒定了兩大產區瓜拉納因地理條件不同而有差異的成分。絡石藤與地瓜藤在性狀上難以鑒別，兩者皆有治療炎癥相關疾病的記載，為初步探究兩種藥材抗炎活性及相關化學成分的差異，本研究利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的體外細胞模型探究絡石藤與地瓜藤對炎癥因子一氧化氮(nitric oxide，NO)的抑制活性差異，并采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術結合偏最小二乘法分析法(OPLS-DA)，對絡石藤和地瓜藤的差異性成分進行分析，進而為絡石藤與地瓜藤的藥效物質基礎研究及質量控制提供理論依據。
1.1 藥材和試劑
所需藥材于2019年12月采自廣西壯族自治區，絡石采自金秀瑤族自治縣，地果采自陽朔縣。干燥樣品經廣西壯族自治區中國科學院廣西植物所黃俞淞副研究員鑒定為絡石(Trachelospermumjasminoides)的帶葉藤莖(絡石藤)與地果(Ficustikoua)的地上部分(地瓜藤)。
質譜純乙腈、甲醇、水和甲酸(美國Honeywell公司)；
DMEM高糖培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；
脂多糖(美國Sigma-Aldrich公司)；
3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽MTT、二甲基亞砜DMSO、吲哚美辛Indomethacin(北京索萊寶科技有限公司)；
一氧化氮測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。
1.2 儀器
UPLC-Q-TOF-MS/MS系統(美國Waters公司)，包括ACQUITY UPLC液相色譜儀，Xevo G2-S Q-TOF質譜儀，配有Lockspray接口及電噴霧離子源(ESI)等；
數據的采集和處理采用MassLynx 4.1質譜工作站；
ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm, 美國Waters公司)；
S30H-D78224型超聲清洗器(德國Elma Sonic公司)；
AL204型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；
3111型CO2培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；
AC2-4S1 生物安全柜(新加坡ESCO公司)；
Infinite M200 PRO 多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)。
1.3 細胞
RAW264.7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
2.1 體外NO抑制活性測試
2.1.1 供試品溶液的制備 分別取絡石藤及地瓜藤各0.2 g，置于20 mL 80%甲醇-水溶液中室溫下超聲提取2次，每次20 min，合并提取液靜置30 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得各樣品甲醇提取物。
2.1.2 細胞及培養 將RAW264.7細胞加入DMEM培養基(含10%胎牛血清)中，置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中培養1～2 d。當細胞密度達到80%～90%時，按照1∶2的比例傳代。
2.1.3 絡石藤和地瓜藤醇提物對RAW264.7細胞的毒性考察 將RAW264.7細胞配置成濃度為6×104個·mL-1的細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板上，放入37 ℃、5% CO2的培養箱中24 h，設置對照組(僅含培養基)和給藥組(含不同濃度絡石藤醇提物、地瓜藤醇提物)，每組3個重復孔。24 h后，除去孔內培養基，每孔添加100 μL含有0.5 mg·mL-1MTT的培養基，于孵箱中培養4 h后棄去培養基，每個孔中添加100 μL二甲基亞砜。在酶標儀490 nm波長下測量吸收波長，并計算細胞存活率。
細胞存活率=(A給藥/A對照)×100%
2.1.4 NO釋放量的檢測 將RAW264.7細胞配置成濃度為1.5×105個·mL-1的細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板上，放入37 ℃、5% CO2的培養箱中12 h，設置空白對照組(僅含培養基)、LPS模型組(含2 μg·mL-1LPS)和給藥組(2 μg·mL-1LPS、LPS+吲哚美辛、LPS+不同濃度絡石藤醇提物和LPS+不同濃度地瓜藤醇提物)，每組設置3個重復孔。24 h后，收集上清液，并采用Griess法測定NO含量，用酶標儀檢測540 nm下的吸光度。
2.2 差異成分分析處理
2.2.1 色譜檢測條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 μm)，采用0.5 mL·min-1的流速進行洗脫，進樣體積設定為1 μL，樣品濃度為2 mg·mL-1。流動相由含有0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)組成，洗脫程序如下：0～1.00 min 5%～18% B；
1.00～2.50 min 18%～20% B；
2.50～4.50 min 20%～25% B；
4.50～5.00 min 25%～70% B；
5.00～7.00 min 70%～75% B；
7.00～9.50 min 75%～98% B；
9.50～11.50 min 98%～5% B；
11.50～13.50 min 5% B。
2.2.2 質譜檢測條件 質譜儀通過電噴霧電離(ESI)源連接到UPLC系統，霧化氣為氮氣，質量掃描范圍m/z100～1 500，累積時間0.2 s。毛細管電壓在負離子模式下為2.42 kV，在正離子模式下為3.00 kV，樣品錐電壓為25 V，提取錐電壓為4 V。對于MS/MS譜圖，優化了不同的碰撞能量(20～50 eV)，以實現結構解析的最大特征片段數。氮氣用于霧化器和去溶劑化，去溶劑化和錐形氣體流速分別為800、20 L·h-1，去溶劑化溫度為550 ℃，源溫度為120 ℃。數據的采集和處理軟件為MassLynx 4.1質譜工作站。
2.2.3 OPLS-DA差異性成分分析 以UPLC-Q-TOF-MS/MS采集所得絡石藤和地瓜藤色譜圖中峰面積量化值為變量，采用SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA分析，絡石藤和地瓜藤樣品呈現一定分類聚集現象。OPLS-DA模型中變量投影重要度(VIP值)越大，表明該指標對區分絡石藤和地瓜藤的貢獻越大(崔婷等，2022)，即可能是區分兩種藥材的差異性成分，確定絡石藤與地瓜藤間的差異性化學成分。利用MassLynx 4.1色譜工作站得到化合物的精確相對分子質量及化合物碎片信息，參照對照品并查閱相關文獻(范明松等，2005；
袁珊琴等，2010；
景玲等，2012；
Liu et al., 2015; Zhao et al., 2017; Zhou et al., 2018; Murugesu et al., 2021; Song et al., 2022; Yao et al., 2022)結合Progenesis QI軟件，鑒定絡石藤與地瓜藤的差異性成分。
3.1 絡石藤和地瓜藤醇提物對RAW264.7細胞活力的影響
與對照組比較，絡石藤醇提物(ethanol extract of the stems with leaves inTrachelospermumjasminoides，TJ)和地瓜藤醇提物(ethanol extract of the aerial parts inFicustikoua，FT)質量濃度在80 mg·L-1時對細胞增殖有明顯的抑制作用，質量濃度小于80 mg·L-1的各給藥組對細胞增殖無明顯抑制作用，結果如圖1所示。以無毒質量濃度設計40、20、10 mg·L-1為高、中、低劑量進行下一步實驗。
(平均值±標準差， n=3)， 與對照組比較， *P<0.05。
n=3), compared with the control group, *P<0.05.圖 1 絡石藤和地瓜藤醇提物對RAW264.7細胞的毒性影響Fig. 1 Cytotoxicity of ethanol extracts of the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides and Ficus tikoua to RAW264.7 cells
3.2 絡石藤和地瓜藤醇提物對LPS刺激RAW 264.7細胞釋放NO的影響
從表1結果可以看出，絡石藤和地瓜藤醇提物均可一定程度抑制LPS刺激RAW264.7細胞釋放NO炎癥因子，并且各組的藥效呈現濃度依賴性。其中，絡石藤醇提物的NO釋放抑制作用稍強于地瓜藤醇提物。
表 1 絡石藤和地瓜藤醇提物對RAW264.7細胞分泌NO的影響Table 1 Effects of ethanol extracts of the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides and Ficus tikoua on NO secretion by RAW264.7 cells
3.3 絡石藤與地瓜藤差異性成分鑒定
OPLS-DA分析結果表明，模型對X變量的可解釋性R2X為0.84，模型對Y變量的可解釋性R2Y為0.999，模型預測能力Q2為0.993，說明對模型的評估良好。從得分圖(圖2)可以看出，絡石藤和地瓜藤醇提物樣品數據點區分明顯，表明絡石藤在化學成分上與地瓜藤有明顯區別。按照該模型X變量對Y變量的解釋能力(variable influence on projection，VIP)大小進行排序，從采集所得絡石藤和地瓜藤色譜圖(圖3)中共鑒定出絡石藤中21個顯著差異性成分(表2)，包括木脂素類10個、苯丙酸類4個、黃酮類2個、三萜類2個、其他類3個。地瓜藤中10個顯著差異性成分(表3)，包括黃酮類7個、木脂素類1個、苯丙酸類1個、三萜類1個。
圖 2 經OPLS-DA 分析的得分圖Fig. 2 Score chart of OPLS-DA analysis
表 2 絡石藤的差異性化學成分鑒定Table 2 Identification of differential chemical constituents from the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides
表 3 地瓜藤的差異性化學成分鑒定Table 3 Identification of differential chemical constituents from the aerial parts in Ficus tikoua
圖 3 絡石藤(A)和地瓜藤(B)的BPI色譜圖Fig. 3 Base peak chromatograms of the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides(A) and Ficus tikoua(B)
3.3.1 木脂素類化合物分析 從表2可以看出，在負離子模式下，化合物1-4的準分子離子峰為m/z697.236 1 [M-H]-，去除兩分子葡萄糖殘基(-162 Da×2)后得到碎片離子m/z373.127 3；
接著，從內酯環上連接2個取代基的季碳上斷裂取代基(-16-136 Da)(Abe et al.,1986; Liu et al., 2015)后得到碎片離子m/z221.068 2；
隨后，內酯環上丟失一分子CO(-28 Da)后，環內形成雙鍵(-2 Da)，得到碎片離子m/z191.056 0。結合文獻(Liu et al., 2015)及質譜斷裂方式，推測該化合物為去甲絡石苷元4,4′-di-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。化合物1-7與化合物1-8以及化合物1-12與化合物1-13為兩對同分異構體，而同分異構體其保留時間接近且裂解途徑無明顯差別。在負離子模式下，化合物1-13的準分子離子峰為m/z595.204 3 [M+HCOO]-，去除一分子葡萄糖殘基(-162 Da)后得到碎片離子m/z387.144 1，緊接著丟失一分子-OCH3得到碎片離子m/z357.133 9，可以推測出化合物的結構間母核上的區別。繼而可推測，化合物1-4、1-7、1-8的母核皆為去甲絡石苷元，化合物1-12與化合物1-13的母核為絡石苷元。同時，結合保留時間與文獻(Liu et al, 2015)上的報道對應，可以推測出化合物1-7與化合物1-8為去甲絡石苷元5′-C-β-葡萄糖苷和去甲絡石苷，化合物1-12與化合物1-13分別為5′-甲氧基羅漢松脂苷和絡石苷。
3.3.2 苯丙酸類化合物分析 苯丙酸類化合物由于結構中含有羧基和酚羥基，其裂解過程中易丟失水分子和羧酸分子，并且容易在羰基處斷裂形成碎片離子。化合物1-1及化合物1-2在負離子模式下，二者的準分子離子峰在m/z353.088 1 [M-H]-左右，可推測二者的分子式為C16H18O9，它們在二級質譜裂解過程中因酯鍵斷裂而形成m/z191.055 4、179.025 3，分別對應于奎寧酸片段、咖啡酸片段(雒曉梅等，2019)。根據文獻(Qi et al., 2009)報道的保留時間，可判斷他們分別為綠原酸及隱綠原酸。
3.3.3 黃酮類化合物 黃酮苷類化合物的裂解通常為糖鏈結構的連續丟失，如鼠李糖(146 Da)或葡萄糖(162 Da)殘基的丟失，從而可以找到黃酮苷元的碎片離子峰。化合物1-6的準分子離子峰為m/z447.092 1 [M-H]-，去除一分子葡萄糖殘基(-162 Da)后得到碎片離子m/z285.039 5，結合文獻(徐萌伶等, 2022)報道推測其為木犀草苷。并且，黃酮類化合物裂解過程中易發生脫水、環的逆狄爾斯-阿爾德反應(RDA)裂解，以及失去CO、CHO等一些中性分子。由于二級質譜中存在m/z285.040 0 [M-H-C12H20O9]-等碎片離子，因此根據文獻(Qian et al., 2010)報道可推測化合物1-5為忍冬苷。
3.3.4 三萜類化合物 通常三萜類化合物在二級質譜裂解過程中，主要是糖鍵的連續性斷裂以及取代基的丟失。化合物1-14的準分子離子峰為m/z727.394 1 [M+COOH]-，分子去除一個葡萄糖殘基(-162 Da)后得到碎片離子m/z519.332 6，結合分子量及文獻(譚興起等，2006)推測其為絡石苷B1。化合物1-16的準分子離子峰為m/z695.364 2 [M-H]-，去除一分子葡萄糖殘基 (-162 Da) 后得到碎片離子m/z517.317 0，隨后因丟失了一分子羧基及羥基(-45-17 Da)而得到碎片離子m/z471.310 5，結合分子量及文獻(譚興起等，2006)報道推測其為絡石苷F。
絡石藤是藥典中記載的我國常用且重要的中藥材，由于其產地和用藥習慣的不同，因此地瓜藤在民間常被用作絡石藤替代品。本研究通過比較絡石藤與地瓜藤醇提物對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放量的影響，發現絡石藤與地瓜藤皆可抑制該炎癥因子釋放，這初步解釋了地瓜藤可在部分地區長期用作絡石藤的合理性。
本研究通過OPLS-DA法證實絡石藤與地瓜藤的化學成分存在明顯差異，絡石藤以二芐基丁內酯類木脂素類成分為主要差異性成分，而地瓜藤則以黃酮類化合物居多，兩類物質均具有抗炎活性。二芐基丁內酯類木脂素類成分具有抗炎、抗腫瘤和平喘等多種作用(毛杰等，2014)，其代表性成分絡石苷為藥典中評價絡石藤藥材質量的主要指標(國家藥典委員會，2020)；
牛蒡子苷元通過抑制轉錄因子p65的核移位等途徑，降低了誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，進一步減少了NO的生產，從而起到抗炎作用(Cho et al., 2002)；
Lee等(2010)研究發現牛蒡子苷和羅漢松脂酚不僅抑制核轉錄因子NF-κB及其調節蛋白的激活， 而且能夠潛在地抑制特異性絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活，從而降低炎癥因子iNOS與COX-2的表達；
Song等(2022)研究發現多個二芐基丁內酯類木脂素成分能抑制LPS誘導的RAW264.7中NO的產生。劉美平等(2010)通過紫外分光光度法，發現絡石藤提取物中的總木脂素含量超過80%，證明該類成分為絡石藤的主要化學成分。地瓜藤中的差異性黃酮類成分，如染料木素可降低LPS誘導的炎癥小鼠的炎癥因子表達(Chen et al., 2018)；
懷特酮具有顯著的NO抑制作用(Anh et al., 2016)；
8-異戊烯基柚皮素可降低體外炎癥模型的炎癥因子表達(Paoletti et al., 2009)等。此外，Yao等(2021)從地瓜藤的同屬植物高山榕果實中分離得到的黃酮類化合物也具有抑制NO的作用。
本研究應用體外細胞實驗觀察絡石藤與地瓜藤的NO抑制活性差異，發現絡石藤對NO釋放的抑制作用稍優于地瓜藤，利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術并結合OPLS-DA方法，發現絡石藤和地瓜藤的主要差異性成分分別是木脂素和黃酮，根據相關文獻報道，推測上述兩類成分分別為兩種藥材抗炎活性的主要藥效物質基礎。本研究結果為絡石藤與地瓜藤的質量控制以及進一步合理開發與利用植物資源提供了理論依據。
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